| Expression and Purification of Functionally Active Serotonin 5-HT2A Receptor in Insect Cells Using Low-titer Viral Stock
|
|
Author:
Date:
2020-08-05
[Abstract] The serotonin 5-HT2A receptor (5-HT2AR) is a member of the GPCR family that is important for various neurological functions and whose dysregulation causes many mental health disorders. Structural investigations of 5-HT2AR require the production of functionally active receptors expressed from eukaryotic cell cultures. In this protocol, we describe a step-by-step method to express and purify serotonin 5-HT2AR using a baculoviral expression vector system in Sf9 cell cultures, derived from our work with the rat (matching Uniprot ID P14842) and human (matching Uniprot ID P28223) 5-HT2ARs. A unique feature of this method is the utilization of cell culture additives to infect cells at low multiplicity of infection, thereby using several fold ...
[摘要] [摘要] 血清素5-HT2A受体（5-HT2AR）是GPCR家族的一员，对多种神经功能起重要作用，其调节失调会导致许多心理健康障碍。5-HT2AR的结构研究需要从真核细胞培养物中产生功能活性受体。在本方案中，我们描述了一种在Sf9细胞培养中使用杆状病毒表达载体系统表达和纯化血清素5-HT2AR的分步方法，该方法来源于我们对大鼠（匹配Uniprot ID P14842）和人类（匹配Uniprot ID P28223）5-HT2AR的研究。这种方法的一个独特的特点是使用细胞培养添加剂以低感染倍数感染细胞，从而使用比不使用添加剂的先前方法少几倍的病毒滴度。该方案可以通过改变感染后收获时间来选择性地过度表达糖基化或非糖基化形式的受体。
[背景]在过去十年中，由于功能活性受体高产表达方法的发展，对GPCRs的结构研究激增（Granier和Kobilka，2012）。其中，5-羟色胺GPCRs是一组小而多样的受体，在神经调节中起着重要作用，它们的功能障碍与许多心理健康障碍有关（Berger等人，2009）。在利用真核宿主进行蛋白质表达的多种方法中，包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞，利用Sf9细胞结合杆状病毒表达系统表达GPCRs因其高产率和可靠性而成为一个突出的方法（Saarenpaa等人，2015年；Wiseman等人，2020年）。然而，各种方法不断发展，以克服现有方法的各种缺点。目前还没有一种统一的、单一的方法来表达所有类型的GPCRs，并没有足够高的产率来进行结构研究。这在一定程度上是由于这些受体的多样性，以及它们的序列需要修改，以使晶体学研究成为可能。单电子显微镜的出现对电子显微镜的研究提出了更高的要求。利用昆虫细胞中杆状病毒表达的现有方法的一个关键要求是获得高滴度的病毒储备，这在许多情况下是非常重要的。此外，对于蛋白质的生产，感染细胞通常在感染的多样性~1-5，需要使用大量的病毒滴度，而病毒滴度会随着时间的推移而耗尽。使用多个批次的病毒滴度可以增加批次间的变异性。因此，强烈需要消耗更少病毒滴度的方法。此外，许多GPCRs的天然形式，包括5-羟色胺受体，具有广泛的糖基化，这不是所有情况下都需要的。因此，任何能够提供主要糖基化或非糖基化形式受体的方法，优选地通过简单改变方案，也是可取的。在这里，我们描述了一种在Sf9细胞中使用杆状病毒表达系统表达和纯化5-HT2AR的方法，与现有方法相比，该方法需要最少的病毒滴度，并且可以通过改变感染后收获时间来选择糖基化程度。该方案基于先前的工作（Wacker等人，2013；Mahesh等人，2018；Mozumder等人，2020），已经标准化，以制备用于高分辨率低温组织结构测定的样品，并且适用于采用类似表达和纯化策略的其他GPCR、膜蛋白和其他可溶性蛋白质。 ...
|
|
|
| In vitro Measurement of CMP-Sialic Acid Transporter Activity in Reconstituted Proteoliposomes
|
|
Author:
Date:
2020-03-20
[Abstract] Nucleotide-sugar transporters (NSTs) facilitate eukaryotic cellular glycosylation by transporting nucleotide-sugar conjugates into the Golgi lumen and endoplasmic reticulum for use by glycosyltransferases, while also transferring nucleotide monophosphate byproducts to the cytoplasm. Mutations in this family of proteins can cause a number of significant cellular pathologies, and wild type members can act as virulence factors for many parasites and fungi. Here, we describe an in vitro assay to measure the transport activity of the CMP-sialic acid transporter (CST), one of seven NSTs found in mammals. While in vitro transport assays have been previously described for CST, these studies failed to account for the fact that 1) commercially available stocks of CMP-sialic acid ...
[摘要] [ 摘要] 核苷酸糖转运蛋白（NST）通过将核苷酸糖结合物转运到高尔基腔和内质网供糖基转移酶使用，同时将核苷酸单磷酸副产物转移到细胞质中，从而促进了真核细胞的糖基化。该蛋白质家族的突变可引起许多重要的细胞病理，野生型成员可充当许多寄生虫和真菌的致病因子。在这里，我们描述了一种体外测定法，以测量CMP-唾液酸转运蛋白（CST）的转运活性，CMP-唾液酸转运蛋白（CST）是在哺乳动物中发现的七个NST之一。虽然在体外 以前已经针对CST进行了转运分析，但这些研究未能说明以下事实：1 ）CMP- 唾液酸（CMP-Sia ）的商业库存由约10％的高亲和力CMP组成，以及2）CMP- SIA 是水解d 到CMP和在水溶液中的唾液酸。在这里，我们描述了一种用非选择性磷酸酶南极磷酸酶治疗CMP-Sia的方法，以将所有游离CMP转化为胞苷。这使我们能够准确地测量重组为蛋白脂质体的纯化CST的底物亲和力和运输动力学。
[ 背景技术]一旦在细胞质或细胞核合成，核苷酸偶联的糖被输送到内质网的内腔（ER）由核苷酸-糖转运蛋白（NSTS）或高尔基体（青木等人，2003）。在这些亚细胞区室中，糖基转移酶利用糖部分糖基化脂质和蛋白质，产生副产物核苷酸单磷酸酯（NMP）（Capasso和Hirschberg，1984 ；Milla和Hirschberg ，1989； ...
|
|
|