| Ratiometric Measurement of Protein Abundance after Transient Expression of a Transgene in Nicotiana benthamiana
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Author:
Date:
2020-09-05
[Abstract] Ratiometric reporters are tools to dynamically measure the relative abundance of a protein of interest. In these systems, a target protein fused to a fluorescent or bioluminescent reporter is expressed with fixed stoichiometry to a reference protein fused to a second reporter. Both fusion proteins are encoded on a single transcript but are separated during translation by a 2A “self-cleaving” peptide. This approach enables changes in the relative abundance of a target protein to be detected sensitively, reducing variability in expression of the ratiometric reporter transgene that may occur across different tissues or transformation events. We recently developed a set of Gateway-compatible plant transformation vectors termed pRATIO that combine a variety of promoters, fluorescent and ...
[摘要] [摘要] 比率报告基因是动态测量目标蛋白质相对丰度的工具。在这些系统中，与荧光或生物发光报告基因融合的靶蛋白以固定的化学计量比与与第二报告基因融合的参考蛋白表达。两种融合蛋白均编码在单个转录本上，但在翻译过程中被2A“自切割”肽隔开。这种方法使目标蛋白质的相对丰度的变化能够被敏感地检测到，从而减少了可能在不同组织或转化事件中发生的比例报告基因转基因表达的变异性。我们最近开发了一套与网关兼容的植物转化载体，称为pRATIO 结合了多种启动子，荧光和生物发光报告基因以及源自口蹄疫病毒的2A肽。在这里，我们详细描述了如何使用双荧光比率记者pRATIO3212检查靶蛋白的瞬时表达后的相对丰度烟草本塞姆氏叶。对于此示例，我们分析了响应于karrikins 和rac -GR24 处理的拟南芥MAX2 1（SMAX1）蛋白抑制子的降解。该方案提供了一种简单，快速，易于扩展的方法，用于体内分析农杆菌浸润的烟草叶片组织中的相对蛋白质丰度。
[背景] Karrikins （KARs ）是在烟雾中发现的丁烯内酯化合物，可刺激拟南芥种子萌发并增强幼苗的光形态发生（Flematti ，2004； Nelson 等，2009、2010 和2012）。拟南芥中的KAR响应需要α/β- 水解酶KARRIKIN对光的敏感性/低敏感性（KAI2 / HTL）（Sun and Ni，2011; ...
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| Production, Purification and Characterization of Recombinant Biotinylated Phytochrome B for Extracellular Optogenetics
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Author:
Date:
2020-03-05
[Abstract] In the field of extracellular optogenetics, photoreceptors are applied outside of cells to obtain systems with a desired functionality. Among the diverse applied photoreceptors, phytochromes are the only ones that can be actively and reversibly switched between the active and inactive photostate by the illumination with cell-compatible red and far-red light. In this protocol, we describe the production of a biotinylated variant of the photosensory domain of A. thaliana phytochrome B (PhyB-AviTag) in E. coli with a single, optimized expression plasmid. We give detailed instructions for the purification of the protein by immobilized metal affinity chromatography and the characterization of the protein in terms of purity, biotinylation, spectral photoswitching and the ...
[摘要] [摘要 ] 在细胞外光遗传学领域，光感受器被应用于细胞外，以获得具有所需功能的系统。在各种应用的感光体中，植物色素是唯一可以通过与细胞相容的红色和远红外光照射而在活性和非活性光态之间主动和可逆地切换的色素。在此协议中，我们描述了在大肠杆菌中拟南芥光敏色素B（PhyB-AviTag ）的光敏域的生物素化变体的生产。 带有一个优化的表达质粒。我们给出了通过固定的金属亲和色谱法纯化蛋白质的详细说明，并根据纯度，生物素化，光谱光开关以及与它的相互作用伴侣PIF6的光依赖性相互作用对蛋白质进行了表征。与以前使用PhyB-AviTag 进行的研究相比，此方案中使用的优化表达质粒简化了生产过程，并显示出更高的产量和纯度。
[背景 ] 在新兴的细胞外光遗传学领域，光感受器被应用于细胞外，例如，以控制生物功能或设计光响应性生物材料（Leung 等，2008；Zhang 等，2015；Chen and Wegner ，2017 ; Lyu 等人，2017 ; Wang 等人，2017 ; Bartelt 等人，2018 ; Beyer 等人，2018a ; Beyer 等人，2018b ; Jia 等人，2018 ; Kolar 等人， 2018 ; Liu 等人，2018 ; Wu 等人，2018 ; Baaske 等人，2019 ; Gil 等人，2019 ; H?rner ...
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