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Author:
Date:
2020-03-05
[Abstract] Autophagy is the main catabolic process in eukaryotes and plays a key role in cell homeostasis. In vivo measurement of autophagic activity (flux) is a powerful tool for investigating the role of the pathway in organism development and stress responses. Here we describe a significant optimization of the tandem tag assay for detection of autophagic flux in planta in epidermal root cells of Arabidopsis thaliana seedlings. The tandem tag consists of TagRFP and mWasabi fluorescent proteins fused to ATG8a, and is expressed in wildtype or autophagy-deficient backgrounds to obtain reporter and control lines, respectively. Upon autophagy activation, the TagRFP-mWasabi-ATG8a fusion protein is incorporated into autophagosomes and delivered to the lytic vacuole. Ratiometric ...
[摘要] [摘要] 自噬是真核生物的主要分解代谢过程，在细胞稳态中起关键作用。体内自噬活性（通量）的测量是研究该途径在生物体发育和应激反应中的作用的有力工具。在这里，我们描述了串联标记测定的重大优化，用于检测拟南芥幼苗表皮根细胞中植物体内的自噬通量。串联标签由TagRFP 和mWasabi组成 荧光蛋白与ATG8a融合，并在野生型或自噬缺陷型背景中表达，分别获得报告基因和对照。自噬激活后，将TagRFP-mWasabi-ATG8a融合蛋白掺入自噬体中并递送至裂解液泡中。对照和报道细胞液泡中低pH耐受的TagRFP 和低pH敏感的mWasabi 荧光的比例定量可以可靠地估计自噬活性。我们为植物生长，成像和半自动数据分析提供了分步协议。该协议提出了一种快速而可靠的方法，该方法可用于需要植物自噬通量定量的任何研究。
[背景 ] 串联标记（TT）分析是定量酵母和哺乳动物细胞中自噬通量的广泛方法（Zhou 等，2012； Klionsky 等，2016； Yoshii和Mizushima，2017）。先前已经描述了适用于植物细胞中使用tobacc研究?BY-2细胞悬浮培养物小号（Hanamata 等人，2013; Klionsky 。等人，2016 ...
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