| Measuring Procaspase-8 and -10 Processing upon Apoptosis Induction
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Author:
Date:
2017-01-05
[Abstract] Apoptosis or programmed cell death is important for multicellular organisms to keep cell homeostasis and for the clearance of mutated or infected cells. Apoptosis can be induced by intrinsic or extrinsic stimuli. The first event in extrinsic apoptosis is the formation of the Death-Inducing Signalling Complex (DISC), where the initiator caspases-8 and -10 are fully activated by several proteolytic cleavage steps and induce the caspase cascade leading to apoptotic cell death. Analysing the processing of procaspases-8 and -10 by Western blot is a commonly used method to study the induction of apoptosis by death receptor stimulation. To analyse procaspase-8 and -10 cleavage, cells are stimulated with a death ligand for different time intervals, lysed and subjected to Western blot analysis ...
[摘要] 细胞凋亡或程序性细胞死亡对于多细胞生物保持细胞稳态和清除突变或感染细胞是重要的。 细胞凋亡可以由内在或外在的刺激诱导。 外源性凋亡中的第一个事件是死亡诱导信号复合物（DISC）的形成，其中引发剂半胱天冬酶-8和-10通过若干蛋白水解切割步骤完全活化并诱导胱天蛋白酶级联导致凋亡细胞死亡。 通过蛋白质印迹分析procaspases-8和-10的处理是通过死亡受体刺激研究凋亡诱导的常用方法。 为了分析procaspase-8和-10切割，用死亡配体刺激细胞不同的时间间隔，裂解，并使用抗半胱天冬酶-8和抗半胱天冬酶-10抗体进行蛋白质印迹分析。 这可以监测胱天蛋白酶切割产物，从而诱导细胞凋亡。
背景 胱天蛋白酶是作为无活性酶原产生并被蛋白水解切割活化的蛋白酶（Degterev等人，2003）。胱天蛋白酶级联的激活是凋亡细胞死亡期间最重要的事件，其诱导凋亡细胞的典型生化和形态学变化。与非活性执行者procaspases相反，启动子胱天蛋白酶8/9/10具有限制性蛋白水解活性，并在高分子量复合物中完全活化（Lavrik等人，2005）。促凋亡受体TNF-R1（肿瘤坏死因子受体1），CD95 / ...
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| Affinity Pulldown of Biotinylated RNA for Detection of Protein-RNA Complexes
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Author:
Date:
2016-12-20
[Abstract] RNA-binding proteins (RBPs) have recently emerged as crucial players in the regulation of gene expression. The interactions of RBPs with target mRNAs control the levels of gene products by altering different regulatory steps, including pre-mRNA splicing and maturation, nuclear mRNA export, and mRNA stability and translation (Glisovic et al., 2008). There are several methodologies available today to identify RNAs bound to specific RBPs; some detect only recombinant molecules in vitro, others detect recombinant and endogenous molecules, while others detect only endogenous molecules. Examples include systematic evolution of ligands by exponential enrichment (SELEX), biotinylated RNA pulldown assay, RNA immunoprecipitation (RIP) assay, electrophoretic mobility shift assay ...
[摘要] RNA结合蛋白（RBP）近来已经成为调控基因表达的关键因素。 RBP与靶mRNA的相互作用通过改变不同的调节步骤来控制基因产物的水平，包括mRNA前体剪接和成熟，核mRNA输出和mRNA稳定性和翻译（Glisovic et al。，2008） ）。目前有几种方法可用于鉴定与特定RBP结合的RNA;一些仅在体外检测重组分子，其他检测重组和内源性分子，而其他检测仅内源性分子。实例包括通过指数富集（SELEX），生物素化RNA下拉测定，RNA免疫沉淀（RIP）测定，电泳迁移率变动测定（EMSA），RNA足迹分析和各种UV交联和免疫沉淀（CLIP）方法如CLIP ，PAR-CLIP和iCLIP（Popova等人，2015）。在这里，我们描述了一种简单而有信息的方法来研究和鉴定RBP与其目标转录物之间相互作用的RNA区域（Panda等人，2014和2016）。其重现性和易用性使得该方案成为识别RBP与特异性RNA之间相互作用的快速有效的方法。
背景 RNA蛋白相互作用严重影响基因表达模式。这些核糖核蛋白（RNP）复合物的鉴定对于理解由RNA结合蛋白（RBP）控制的调控机制是必不可少的。最近，广泛的努力导致了开发用于系统分析RNA-蛋白质相互作用的方法。识别RNP复合物的高度信息化方法包括许多不同类型的RNP免疫沉淀（IP）分析。 ...
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| Isolation of Latex Bead Phagosomes from Dictyostelium for in vitro Functional Assays
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Author:
Date:
2016-12-05
[Abstract] We describe a protocol to purify latex bead phagosomes (LBPs) from Dictyostelium cells. These can be later used for various in vitro functional assays. For instance, we use these LBPs to understand the microtubule motor-driven transport on in vitro polymerized microtubules. Phagosomes are allowed to mature for defined periods inside cells before extraction for in vitro motility. These assays allow us to probe how lipids on the phagosome membrane recruit and organize motors, and also measure the motion and force generation resulting from underlying lipid-motor interactions. This provides a unique opportunity to interrogate native-like organelles using biophysical and biochemical assays, and understand the role of motor proteins in phagosome maturation ...
[摘要] 芽顶端分生组织（SAM）是通过细胞分裂不断更新自身的细胞的集合，并且还向新发育的器官提供细胞。已知CLAVATA（CLV）3肽调节转录因子WUSCHEL（WUS）以保持未分化细胞的数量恒定并维持SAM的大小。在非细胞自主信号级联中的CLV3和WUS的交互反馈控制确定SAM中的干细胞命运（多能性的维持，或者，分化成子细胞）。 Ca 2 + 是在许多信号传导途径中起重要作用的第二信使。连接CLV3结合其受体和WUS表达的信号系统没有很好地描绘。我们显示Ca 2 + 参与SAM大小的CLV3调节。我们使用的方法之一是测量SAM的大小。在这里，我们提供了一个详细的协议，如何用Nomarski显微镜测量拟南芥SAM大小。将代表SAM的最大"面"的二维圆顶的面积用作SAM大小的代表。在存在和不存在Ca 2+通道阻断剂Gd 3+和sLV 3肽的情况下对野生型（WT）拟南芥进行研究。 ，以及缺乏功能性CLV3（ clv3 ）或编码Ca 2+ 2+导电离子通道的基因（'dnd1 '）的基因型。 关键字： 拟南芥，射击顶端分生组织，苗发育，细胞信号，幼苗 > Nomarski显微镜广泛用于研究拟南芥SAM大小。用于SAM观察的其他显微技术是耗时的，并且需要将树脂嵌入树脂中，然后切片或甚至更复杂的显微镜。 ...
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