| Purification of FLAG-tagged Secreted Proteins from Mammalian Cells
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Author:
Date:
2017-08-05
[Abstract] This protocol describes a method for purifying glycosylated FLAG-tagged secreted proteins with disulfide bonds from mammalian cells. The purified products can be used for various applications, such as ligand binding assays.
[摘要] 该方案描述了一种用于从哺乳动物细胞中用二硫键纯化糖基化的FLAG标记的分泌蛋白的方法。 纯化的产物可用于各种应用，例如配体结合测定。
【背景】电子。大肠杆菌是从原核生物和真核生物生产重组蛋白质的首选生物之一。细菌表达系统的主要优点是生产率高，成本低。然而，成熟蛋白质对于功能分析是必需的（例如，配体结合测定）。大多数分泌的真核蛋白通过共价聚糖键和在内质网中形成二硫键进行翻译后修饰。这些共价修饰对于分泌的成熟蛋白的一般稳定性和折叠是必需的。因此，生产哺乳动物分泌蛋白质的最佳方法是使用哺乳动物宿主来确保经过适当的翻译后修饰的重组蛋白的产生。在以下方案中，我们已经描述了从哺乳动物细胞中纯化分泌蛋白质的详细程序。该方案用于生产标记有FLAG标签的蛋白质，但也适用于其他标记（例如，His标签）蛋白质的蛋白质。
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| EAE Induction by Passive Transfer of MOG-specific CD4+ T Cells
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Author:
Date:
2017-07-05
[Abstract] Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an animal model of multiple sclerosis (MS), which is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS). It is characterized by focal demyelination and inflammatory responses mediated by myelin-specific autoreactive CD4+ T cells. Using a passive transfer model of EAE in mice, we have demonstrated that regional specific neural signals by sensory-sympathetic communications create gateways for immune cells at specific blood vessels of the CNS, a phenomenon known as the gateway reflex (Arima et al., 2012; Tracey, 2012; Arima et al., 2013; Sabharwal et al., 2014; Arima et al., 2015b). Here we describe protocols for passive transfer model of EAE using freshly isolated (MOG)-specific ...
[摘要] 实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是多发性硬化症（MS）的动物模型，其是中枢神经系统（CNS）的慢性炎性疾病。其特征在于由髓磷脂特异性自身反应性CD4 + T细胞介导的局灶性脱髓鞘和炎症反应。在小鼠中使用EAE的被动转移模型，我们已经证明，通过感觉交感通信的区域特异性神经信号在CNS的特定血管上产生免疫细胞的网关，这被称为网关反射（Arima等， ，2012; Tracey，2012; Arima等人，2013; Sabharwal等人，2014; Arima等人。 >，2015b）。在这里，我们描述了使用新鲜分离的（MOG）特异性CD4 + T细胞或周期性再刺激的MOG特异性CD4 + T细胞系的EAE的被动转移模型的方案，其是适用于体内追踪致病性CD4 T细胞，特别是CNS（Ogura等人，2008; Arima等人） 。，2012和2015b）。
【背景】广泛接受的是，自身反应性CD4 + T细胞在MS和EAE的发病机理中起重要作用（Reboldi，2009; International Multiple Sclerosis Genetics，et al。，2011; Steinman，2014），它们是CNS的慢性炎性疾病。 ...
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| Stereotaxic Surgery for Suprachiasmatic Nucleus Lesions in Mice
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Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] Site-specific lesions are invaluable methods for investigating the function of brain regions within the central nervous system and can be used to study neural mechanisms of behaviors. Precise stereotaxic surgery is required to lesion small regions of the brain such as the suprachiasmatic nucleus (SCN), which harbors the master circadian clock. In this protocol, we describe stereotaxic surgery optimized for bilateral lesion of the mouse SCN by loading electric current. Success of the SCN lesion is verified histologically and behaviorally by monitoring arrhythmic locomotor activity. The SCN-lesioned mouse allows for the evaluation of behavioral, biochemical, and physiological consequences of ablation of the master circadian clock.
[摘要] 位点特异性病变是调查中枢神经系统中脑区功能的有价值的方法，可用于研究神经行为机制。 需要精确的立体定位手术来对大脑的小区域进行损伤，例如含有主昼夜节律钟的视交叉上核（SCN）。 在本协议中，我们介绍了通过加载电流优化小鼠SCN双侧病变的立体定位手术。 通过监测心律失常运动活动，组织学和行为学验证了SCN病变的成功。 SCN损伤的小鼠允许评估主昼夜节律钟的消融的行为，生化和生理后果。
【背景】视交叉上核（SCN）是哺乳动物脑下丘脑内的一个小区域。它位于视交叉的两侧，包含约20,000个神经元。 SCN被称为主昼夜节律振荡器（时钟）的位置，并且与亮 - 暗循环同步所需。 SCN的消融是评估主昼夜节律钟的生理影响的有用策略。
与通过病毒注射或SCN特异性启动子的基因修饰相比，SCN的电解损伤具有能够快速和局部消除主昼夜节律钟的优点。通过Nissl染色手术后可以通过电脉冲定位病变，手术后一天可以开始监测活动节律。此外，通过施用化学物质的病变通常导致非特异性损伤，因此其不像电脉冲的损伤那样精确，特别是对于诸如SCN的小靶标。因此，该协议提供了一个有用的策略来评估主昼夜节律钟的效果（输出）。
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