| Isolation and Quantification of Plant Extracellular Vesicles
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Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] Extracellular vesicles (EVs) play an important role in intercellular communication by transporting proteins and RNA. While plant cells secrete EVs, they have only recently been isolated and questions regarding their biogenesis, release, uptake and function remain unanswered. Here, we present a detailed protocol for isolating EVs from the apoplastic wash of Arabidopsis thaliana leaves. The isolated EVs can be quantified using a fluorometric dye to assess total membrane content.
[摘要] 细胞外囊泡（EVs）通过传递蛋白质和RNA在细胞间通讯中发挥重要作用。 虽然植物细胞分泌电动汽车，但是它们最近才被孤立，并且关于它们的生物发生，释放，摄取和功能的问题仍然没有得到回答。 在这里，我们提出了一个详细的方案，用于从拟南芥叶片的脱水洗涤中分离EV。 可以使用荧光染料定量分离的EV，以评估总膜含量。
【背景】细胞外囊泡（EVs）是介导蛋白质，脂质和遗传物质的细胞与细胞转移的膜结合结构。由于哺乳动物EVs转运RNA和调节免疫反应的能力，对哺乳动物EV的兴趣已经增长。哺乳动物EV通常被分离用于从培养细胞的培养基中研究，以及生物流体的增长列表（Colombo等，2014）。植物电动车也被认为在免疫反应中起作用，但比较缺乏（An et al。，2007; Davis et al。，2016）。这在很大程度上归因于没有孤立的方法。
虽然植物EVs自1967年以来一直被观察到，使用透射电子显微镜，但直到2009年才开发出分离方法（Halperin和Jensen，1967）。 ...
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| In vitro Assays for the Detection of Calreticulin Exposure, ATP and HMGB1 Release upon Cell Death
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Author:
Date:
2016-12-20
[Abstract] Accumulating evidence is revealing the essential role of immune system in cancer treatment. Certain chemotherapeutic drugs can potently induce the release of ‘cell death associated molecular patterns’ (CDAMPs), which accompanies cancer cell demise. CDAMPs can engage corresponding receptors on immune cells and stimulate immune responses to achieve long-term tumor control (Ma et al., 2013; Ma et al., 2014; Yang et al., 2015). Among reported CDAMPs, calreticulin (CALR), ATP and HMGB1 are well known for their immune-stimulatory effect. Here we describe the assays that we applied to measure cell death and these CDAMPs. Briefly, cell death can be analyzed by co-staining of 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) with 3,3’-Dihexyloxacarbocyanine Iodide [DiOC6(3)] or ...
[摘要] 积累的证据表明免疫系统在癌症治疗中的重要作用。某些化学治疗药物可以有效诱导伴随癌细胞死亡的“细胞死亡相关分子模式”（CDAMPs）的释放。 CDAMP可以与免疫细胞上的相应受体结合并刺激免疫应答以实现长期的肿瘤控制（Ma等，2013; Ma等人，2014; Yang＆ em>等，，2015）。在所报道的CDAMP中，钙网蛋白（CALR），ATP和HMGB1是众所周知的免疫刺激作用。在这里我们描述我们应用于测量细胞死亡和这些CDAMPs的测定。简单地说，细胞死亡可以通过4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）与3,3'-二氧基氧羰基花青氨基碘[DiOC6（3）]或Annexin V的共染色来分析。通过流式细胞术检测。 ATP和HMGB1释放可以通过发光测定和ELISA测定分别进行定量。
背景 乳酸脱氢酶测定和台盼蓝染色是检测细胞死亡的传统方法。我们在这里描述两种可行和经济的解决方案，以通过流式细胞术（FCM）检测凋亡和坏死细胞死亡。 DAPI标记具有破坏完整性（坏死）的细胞，而膜联蛋白V结合磷脂酰丝氨酸（其在凋亡后被外化）。 DiOC6（3）摄取表明线粒体跨膜电位（MTP），MTP的崩解显示凋亡。 DAPI不需要补偿藻红蛋白（PE，其与膜联蛋白V蛋白结合）或DiOC6（3），因此在这些测定中显示优于碘化丙啶（PI）的优点。 ...
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| Flow Cytometric Detection of Mitochondrial Membrane Potential
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Author:
Date:
2013-04-20
[Abstract] Mitochondrial membrane potential (Δψm) is an important parameter of mitochondrial function and an indicator of cell health. Depletion of Δψm suggests the loss of mitochondrial membrane integrity reflecting the initiation of the proapoptotic signal. Recently, lipophilic cationic fluorescent dyes have been developed to detect Δψm by accumulating in the mitochondrial matrix until the Nernstian equilibrium distribution of lipophilic cations is reached. In this protocol, we applied a cell-permeant, green-fluorescent, lipophilic dye 3,3'-dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6(3)) which accumulates in mitochondria due to their large negative membrane potential, it can be applied to monitor the mitochondrial membrane potential using flow cytometric detection.
[摘要] 线粒体膜电位（Δψm）是线粒体功能的重要参数和细胞健康的指标。 Δψm的消耗暗示线粒体膜完整性的丧失反映了促细胞凋亡信号的启动。 最近，已经开发了亲脂性阳离子荧光染料来通过在线粒体基质中积累来检测Δψm，直到达到亲脂阳离子的能斯特平衡分布。 在这个协议中，我们应用细胞渗透，绿色荧光，亲脂染料3,3'-二己氧基碳菁碘化物（DiOC6（3））积累在线粒体，由于他们大的负膜电位，它可以应用于监测线粒体 膜电位使用流式细胞术检测。
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