| Novel Protein-oligonucleotide Conjugation Method Involving a High-affinity Capture HaloTag
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Author:
Date:
2020-09-20
[Abstract] Highly sensitive quantitative protein profiling can play a key role in the early diagnosis of diseases, such as autoimmune diseases and cancer. We developed a modified protein-oligonucleotide conjugation method termed HaloTag-mediated barcoding, for quantifying protein molecules at a higher sensitivity than conventional protein quantification methods. This novel and efficient conjugation method can be used to prepare HaloTag-barcoded proteins using a click chemistry-based labeling technique. Here, we describe the preparation of protein-DNA complexes and detection of protein-protein interactions which can be used in a HaloTag protein barcode assay to detect an antibody. The protocol includes procedures for preparing the ligand-oligonucleotide complex, plasmid DNA preparation for protein ...
[摘要] [摘要 ] 高灵敏度的定量蛋白质谱分析可以在疾病的早期诊断中发挥关键作用，例如自身免疫性疾病和癌症。我们开发了一种改良的蛋白质-寡核苷酸缀合方法，称为HaloTag 介导的条形码，用于以比常规蛋白质定量方法更高的灵敏度来定量蛋白质分子。可以使用这种基于点击化学的标记技术，将这种新颖而有效的结合方法用于制备HaloTag 条形码蛋白。在这里，我们描述了可在HaloTag中使用的蛋白质-DNA复合物的制备和蛋白质-蛋白质相互作用的检测 蛋白质条形码检测以检测抗体。该方案包括制备配体-寡核苷酸复合物的程序，用于蛋白质表达的质粒DNA制备以及蛋白质-寡核苷酸复合物的制备。所描述的基于点击反应的方案简化了常规胺-酯反应方法，该方法需要色谱纯化的额外步骤。
[背景 ] 蛋白质分子可通过常规实验进行定量酶联免疫吸附测定法，western印迹和质谱的方法，例如。这些常规的定量蛋白质谱分析技术涉及使用校准曲线进行相对测量，而没有考虑DNA扩增的高灵敏度，这限制了蛋白质本身绝对量的检测。化学蛋白质组学成为可能多重测定我n中的相对定量方式，例如串联质量标签标记方法加上质谱（汤普森等人，2003 ）。蛋白质条形码技术与下一代测序技术相结合已经可以识别目标蛋白质分子。这些方法包括CITE- SEQ ，的Ab- SEQ 和L1 BRA- SEQ ...
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| Optical Clearing and Index Matching of Tissue Samples for High-resolution Fluorescence Imaging Using SeeDB2
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Author:
Date:
2018-10-20
[Abstract] Tissue clearing techniques are useful for large-scale three-dimensional fluorescence imaging of thick tissues. However, high-resolution imaging deep inside tissues has been challenging, as it is extremely sensitive to light scattering and spherical aberrations. Here, we present a water-based optical clearing and mounting media, SeeDB2, which is designed for high numerical aperture (NA) objective lenses with oil or glycerol immersion. Using quick and simple soaking procedures, the refractive indices of samples can be matched either to that of immersion oil (1.52) or glycerol (1.46), thus minimizing light scattering and spherical aberrations. Fine morphology and various fluorescent proteins are highly preserved during the clearing and imaging process. Our method is useful for the ...
[摘要] 组织清除技术可用于厚组织的大规模三维荧光成像。然而，高分辨率成像深层组织一直是一个挑战，因为它对光散射和球面像差极为敏感。在这里，我们提出了一种水基光学清除和安装介质SeeDB2，它是专为高数值孔径（NA）物镜和油或甘油浸泡而设计的。使用快速简单的浸泡程序，样品的折射率可以与浸油（1.52）或甘油（1.46）相匹配，从而最大限度地减少光散射和球面像差。在清理和成像过程中，高度保留了良好的形态和各种荧光蛋白。我们的方法可用于使用共聚焦和超分辨率显微镜在突触分辨率下的神经元电路的三维荧光成像。 SeeDB2也可用作荧光蛋白超分辨率成像的封固介质。
【背景】生物组织以3D组织。此外，许多重要的细胞机器，例如，例如，神经元中的突触，是亚微米级的。因此，对用于亚微米级3D成像的方法的需求不断增加。串联电子显微镜技术（例如>，FIB-SEM或SBF-SEM）很有前景，但它们无法充分利用现代生命科学中可用的基因荧光标记工具。为了利用荧光显微镜促进3D成像，近年来已经开发了许多组织清除技术（Richardson和Lichtman，2015和2017）。它们专为大规模3D成像而设计，其中一些可用于全脑，甚至是固定样品的全身尺度荧光成像，结合共焦，双光子或光片显微镜。然而，其中许多尚未针对高分辨率成像进行全面优化。
在荧光显微镜中，横向分辨率（ d >）给出如下：
d ...
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