| An Imaging Flow Cytometry Method to Measure Citrullination of H4 Histone as a Read-out for Neutrophil Extracellular Traps Formation
|
|
Author:
Date:
2021-02-20
[Abstract] The formation of neutrophil extracellular traps (NETs) is thought to play a critical role in infections and propagating sterile inflammation. Histone citrullination is an essential and early step in NETs formation, detectable prior to the formation of the hallmark extracellular DNA-scaffolded strands. In addition to the classical microscopy method, new technologies are being developed for studies of NETs and their detection, both for research and clinical purposes. Classical microscopy studies of NETs are subjective, low throughput and semi-quantitative, and limited in their ability to capture the early steps. We have developed this novel Imaging Flow Cytometry (IFC) method that specifically identifies and quantifies citrullination of histone H4 as a NETs marker and its relationship with ...
[摘要] [摘要]中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的形成被认为在感染和传播无菌炎症中起关键作用。组蛋白瓜氨酸化是NETs形成中必不可少的早期步骤，可在形成标志性的细胞外DNA支架链之前检测到。除了经典的显微镜方法外，还在研究和临床目的开发用于NETs及其检测的新技术。NET的经典显微镜研究具有主观性，低通量和半定量性，并且捕获早期步骤的能力有限。我们开发了这种新颖的成像流式细胞仪 （IFC）方法，专门识别和量化组蛋白H4的瓜氨酸化作为NETs标记及其与核和细胞水平其他改变的关系。这些包括核解聚和超缩合，多分叶状核与1-叶核和细胞膜损伤。在形成特定的细胞外DNA支架链之前，可以在用NETs诱导剂进行不同的治疗期后对NETs标记物进行定量。由于这些高通量基于图像的细胞分析功能可以通过严格的统计来执行，因此该协议适用于实验和临床应用以及作为生物标志物的NETosis的临床评估。
[背景]活化的中性粒细胞迅速募集到感染和受伤的地方；它们有助于宿主抵抗病原体和炎症。大约在二十年前，首次观察到对病原体的反应是，一部分中性粒细胞会经历细胞凋亡或坏死以外的不同类型的细胞死亡。这涉及染色质的早期缩合，核区室和颗粒区室的共定位，最后将这种混合物释放到环境中。锚定核成分（例如组蛋白）或细胞成分的细胞外DNA支架链，其中一些具有很强的抗病原特性，例如弹性蛋白酶或髓过氧化物酶（MPO），被称为“嗜中性细胞外陷阱”或NETs，并具有有效的抗菌活性（Brinkmann等人，2004）。最近的证据表明，母语也非感染性疾病，包括癌症，系统性关联红斑狼疮，镰状细胞病，动脉粥样硬化和血栓形成（Jorch和Kubes，2017年）。尚不清楚NETs或其任何成分（无细胞DNA或组蛋白）是否作为驱动因素导致了这些疾病的病理，或者它们是否是免疫反应失衡的副产物。NETs在某些疾病中也可能充当生物标志物，并提供有关治疗方案功效的信息（Barnado等，2016）。NETs相关成分（例如弹性蛋白酶或MPO）存在于自身免疫性疾病患者的血浆中，也存在于感染中，这使这些分子作为生物标记物的特异性变得复杂。因此，迫切需要用于NETs表征的新方法，这些方法应在研究之间提供一致的标准，并且对于机械和临床应用均可靠。 ...
|
|
|
| HIVGKO: A Tool to Assess HIV-1 Latency Reversal Agents in Human Primary CD4+ T Cells
|
|
Author:
Date:
2018-10-20
[Abstract] While able to suppress HIV replication in HIV infected individuals, combination antiretroviral therapy (ART) fails to eliminate viral latent reservoir, which consists in integrated transcriptional silenced HIV provirus. So far, identification of latently-infected cells has relied on activating cells to induce expression of HIV proteins which can then be detected. Unfortunately, this activation significantly changed the cell phenotype. We developed a novel HIV reporter, named HIVGKO, that allows the purification of latently-infected cells in absence of reactivation. Indeed, latent cells can be identified by expression of the EF1a-driven mKO2 and lack of expression of the LTR-driven csGFP. This protocol can be used to study the effectiveness of LRAs (Latency Reversal Agents) in ...
[摘要] 虽然能够抑制HIV感染个体中的HIV复制，但联合抗逆转录病毒疗法（ART）无法消除病毒潜伏性储库，其包含整合的转录沉默的HIV原病毒。 到目前为止，潜伏感染细胞的鉴定依赖于激活细胞以诱导HIV蛋白的表达，然后可以检测到这些蛋白的表达。 不幸的是，这种激活显着改变了细胞表型。 我们开发了一种名为HIV GKO 的新型HIV报告基因，可以在没有再激活的情况下纯化潜伏感染的细胞。 实际上，可以通过EF1a驱动的mKO2的表达和LTR驱动的csGFP的缺乏表达来鉴定潜伏细胞。 该方案可用于研究LCA（潜伏期逆转剂）在原代细胞中重新激活潜伏HIV的有效性。
【背景】新版双标记病毒（HIV GKO ）含有5'LTR中HIV-1启动子控制下的密码子转换eGFP（csGFP）和一种独特的无关荧光蛋白 mKO2在细胞延伸因子αα启动子（EF1α）的控制下。 当使用与遗传相关的荧光蛋白时，由于重组问题，在这些报道分子中使用不相关的荧光蛋白是很重要的。 因此，生产性感染的细胞主要是csGFP + mKO2 + （有些可能只是GFP + ），而潜伏感染的细胞是csGFP - mKO2 + 。 流式细胞仪如分拣机AriaII允许纯化纯感染人群（生产性，潜伏性和/或未感染），而分析仪LSRII允许评估HIV GKO LTR的转录激活。 感染后的时间很短。
|
|
|