| Native Co-immunoprecipitation Assay to Identify Interacting Partners of Chromatin-associated Proteins in Mammalian Cells
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Author:
Date:
2020-12-05
[Abstract] Protein-protein interactions play key roles in nuclear processes including transcription, replication, DNA damage repair, and recombination. Co-immunoprecipitation (Co-IP) followed by western blot or mass spectrometry is an invaluable approach to identify protein-protein interactions. One of the challenges in the Co-IP of a protein localized to nucleus is the extraction of nuclear proteins from sub-nuclear fractions without losing physiologically relevant protein interactions. Here we describe a protocol for native Co-IP, which was originally used to successfully identify previously known as well novel topoisomerase 1 (TOP1) interacting proteins. In this protocol, we first extracted nuclear proteins by sequentially increasing detergent and salt concentrations, the extracted fractions were ...
[摘要] [摘要]蛋白质间相互作用 在核过程中起关键作用，包括转录，复制，DNA损伤修复和重组。免疫共沉淀（Co-IP），然后进行蛋白质印迹或质谱分析是鉴定蛋白质-蛋白质相互作用的宝贵方法。在Co-IP中定位于细胞核的蛋白质中的挑战之一是从亚核级分中提取核蛋白质，而又不会失去生理上相关的蛋白质相互作用。在这里，我们描述了一种用于天然Co-IP的协议，该协议最初用于成功地识别以前称为新拓扑拓扑异构酶1（TOP1）相互作用的蛋白质。在此协议中，我们首先通过依次增加去污剂和盐浓度来提取核蛋白，然后将提取的级分稀释，合并并用于Co-IP。该协议可用于鉴定多种哺乳动物细胞中其他染色质相关蛋白的蛋白相互作用组。
背景]钴- IP被广泛地被使用，以解开的错综复杂的关系之间的蛋白复合物和各种染色质交易期间的复制，转录，和基因组的维护。但是，它是具有挑战性的，以保持不稳定的蛋白质-蛋白质相互作用的完整过程中提取，免疫沉淀和一个共同的IP实验的洗涤步骤。稳定不稳定蛋白质相互作用的一种方法是在细胞裂解之前用细胞可渗透的可逆化学交联剂（例如丙酸二硫代双琥珀酰亚胺酯）处理细胞（Smith等人，2011）。由于该方法伴随着诸如提取效率低和非特异性蛋白质捕获之类的缺点，因此优选不交联的Co-IP（天然IP）。
一核蛋白质可以被分配到不同的子-核舱或染色质区域是需要不同程度的严格性为它的提取和溶解。对于例如，TOP ...
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| Quantification of Fatty Acids in Mammalian Tissues by Gas Chromatography–Hydrogen Flame Ionization Detection
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Author:
Date:
2020-05-05
[Abstract] In mammalian organisms, fatty acids (FAs) exist mostly in esterified forms, as building blocks of phospholipids, triglycerides, and cholesteryl esters, while some exist as non-esterified free FAs. The absolute quantification of FA species in total lipids or in a specific lipid class is critical in lipid-metabolism studies. To quantify FAs in biological samples, gas chromatography–hydrogen flame ionization detection (GC-FID)-based methods have been used as highly robust and reliable techniques. Prior to GC-FID analysis, FAs need to be derivatized to volatile FA methyl esters (FAMEs). The derivatization of unsaturated FAs using classical derivatization methods that rely on high reaction temperature requires skill; consequently, the quantification results are often unreliable. The recently ...
[摘要] [摘要] 在哺乳动物生物，脂肪酸（FAS）多云存在处于酯化形式，积木磷脂，甘油三酯和胆固醇酯，而一些存在非酯化游离Fas，绝对定量FA物种在总脂质为了定量分析生物样品中的FA，基于气相色谱-氢火焰离子化检测（GC-FID）的方法已被用作高度健壮和可靠的技术。在FID分析中，FA需要衍生为挥发性FA甲酯（FAME）。使用依赖于高反应温度的经典衍生化方法对不饱和FA进行衍生需要技巧;最终，定量结果通常是不可靠的。程序可以快速可靠地衍生出多种FA物种，包括多不饱和FA（PUFA）。要分析哺乳动物组织样品中的FA，脂质提取 作用和分级分离对于稳健分析也至关重要。在本报告中，我们描述了基于GC-FID的哺乳动物组织样品FA定量的完整方案，包括脂质提取，分级分离，衍生化和定量。 FAs，特别是不饱和FAs，需要可靠地定量。
[背景] 一个˚F 阿蒂酸（FA）是羧酸与脂肪链，和FAS被归类根据自己的链长（短，中，长，很长）的数量和分子内双键（饱和，单在哺乳动物生物体中，FAs主要以酯化形式存在，例如磷脂（PLs），甘油三酸酯（TGs）和胆甾醇酯.PLs是生物膜的主要成分，而TGs作为集中的能量储存体很重要，胆固醇酯和胆固醇酯在胆固醇代谢中起作用（Hishikawa 等，2014 ；Nielsen 等，2014 ；Hui和Howles，2005 ；Van Meer ...
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| Dissection and Whole Mount Staining of Retina from Neonatal Mice
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Author:
Date:
2018-10-05
[Abstract] Here we provide a detailed protocol for whole mount staining of mouse retina. This protocol was used to analyze retinal angiogenesis in newborn mice (Sawaguchi et al., 2017) by modifying the original protocols (Powner et al., 2012; Tual-Chalot et al., 2013). This protocol can also be used for whole mount staining of adult retina.
[摘要] 在这里，我们提供了小鼠视网膜整体染色的详细方案。 该方案用于分析新生小鼠的视网膜血管生成（Sawaguchi et al。，2017），修改原始方案（Powner et al。，2012; Tual-Chalot et al。，2013）。 该方案也可用于成人视网膜的整体染色。
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