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Date:
2018-10-05
[Abstract] The cyclic-nucleotide modulated ion channel family includes cyclic nucleotide-gated (CNG) and hyperpolarization-activated and cyclic nucleotide-modulated (HCN) channels, which play essential roles in visual and olfactory signaling and the heart pacemaking activity. Functionally, these channels have been extensively characterized by electrophysiological techniques from protein heterologously expressed in Xenopus oocytes and mammalian cells. On the other hand, expression and purification of these proteins for biophysical and structural analyses in vitro is problematic and expensive and, accordingly, only limited information on the purified channels is available in the literature. Here we describe a protocol for binding studies of fluorescently labeled cyclic nucleotides to a ...
[摘要] 环核苷酸调节的离子通道家族包括环核苷酸门控（CNG）和超极化激活和环核苷酸调节（HCN）通道，其在视觉和嗅觉信号传导和心脏起搏活动中起重要作用。在功能上，这些通道已经通过来自非洲爪蟾卵母细胞和哺乳动物细胞中异源表达的蛋白质的电生理学技术进行了广泛的表征。另一方面，这些蛋白质的表达和纯化用于体外生物物理和结构分析是有问题且昂贵的，因此，文献中仅提供关于纯化通道的有限信息。在这里，我们描述了用于将荧光标记的环核苷酸与真核CNG通道的同源物结合研究的方案。此外，我们描述了如何在竞争测定中直接探测未标记的环核苷酸的结合。使用荧光作为配体结合的灵敏探针可减少所需蛋白质的量，并使用标准实验室设备进行快速简便的测量。
【背景】了解蛋白质在分子细节中的功能需要广泛的微观表征。对于配体门控离子通道，需要进行不同的分析以获得有关蛋白质与配体的特异性相互作用，配体结合位点和孔隙之间的通信以及通道特异性特征（如离子通量和失活或脱敏）的信息。属性。与对应于各种功能状态的通道构象的结构数据一起，这允许开发通道功能和调节的完整机械描述。环核苷酸门控（CNG）离子通道是四聚体钾通道，由于它们在嗅觉和视觉信号级联中的功能而特别受关注（Kaupp和Seifert，2002; Craven和Zagotta，2006）。然而，在确定的条件下，纯化的CNG通道的数据非常有限，主要来自单分子力谱（Higgins ...
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