| CENP-C Phosphorylation by CDK1 in vitro
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Author:
Date:
2021-01-05
[Abstract] Accurate chromosome segregation during mitosis requires the kinetochore, a large protein complex, which makes a linkage between chromosomes and spindle microtubes. An essential kinetochore component, CENP-C, is phosphorylated by Cyclin-B-Cyclin dependent kinase 1 (CDK1) that is a master kinase for mitotic progression, promoting proper kinetochore assembly during mitosis. Here, we describe an in vitro CDK1 kinase assay to detect CENP-C phosphorylation using Phos-tag SDS-PAGE without radiolabeled ATP. Our protocol has advantages in ease and safety over conventional phosphorylation assays using [γ-32P]-ATP, which has potential hazards despite their better sensitivity. The protocol described here can be applicable to other kinases and be also useful for analysis of phospho-sites in ...
[摘要] [摘要]在有丝分裂过程中，准确的染色体分离需要动线粒体（一种大型蛋白复合物），使染色体与纺锤体微管之间形成联系。必需的线粒体成分CENP-C被细胞周期蛋白B-细胞周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）磷酸化，该激酶是有丝分裂进程的主要激酶，在有丝分裂过程中促进适当的线粒体组装。在这里，我们描述了一种体外CDK1激酶测定法，可使用Phos -tag SDS-PAGE检测CENP-C磷酸化而无放射性ATP 。ø乌尔协议具有使用[γ-在容易且安全优于常规磷酸化试验的优点32 P] -ATP ，其具有潜在危险，尽管其敏感性更高。该协议describ编这里可以适用于其他激酶并且也用于在基板磷酸位点的分析是有用的体外。
[背景]细胞周期蛋白-B细胞周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）是有丝分裂的主要调节剂，其磷酸化许多靶标以确保有丝分裂的进展（Nurse，1990 ; Malumbres and Barbacid ，2005 ）。在有丝分裂期间，携带遗传信息的染色体被平均分为两个子细胞。线粒体是关键的大蛋白复合物，通过在染色体和纺锤体微管之间架桥来确保忠实的染色体分离（Fukagawa和Earnshaw，2014）。组成动线粒的各种蛋白质被CDK1磷酸化（Gascoigne等人，2013; Nishino等人，2013; Hara等人，2018b; ...
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| Liposome Flotation Assay for Studying Interactions Between Rubella Virus Particles and Lipid Membranes
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Author:
Date:
2018-08-20
[Abstract] Rubella virus (RuV) is an enveloped, positive-sense single-stranded RNA virus that is pathogenic to humans. RuV binds to the target cell via the viral envelope protein E1, but the specific receptor molecules on the target cell are yet to be fully elucidated. Here, we describe a protocol for liposome flotation assay to study direct interactions between RuV particles and lipid membranes in a qualitative manner. Interactions are examined by a Nycodenz density gradient fractionation using UV-inactivated RuV particles and fluorescent-labeled liposomes consisting of pure lipids. Fractionated RuV particles are detected using standard sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) followed by Western blot analysis for viral proteins. On the Nycodenz gradient, RuV particles ...
[摘要] 风疹病毒（RuV）是一种包膜的正义单链RNA病毒，对人类具有致病性。 RuV通过病毒包膜蛋白E1与靶细胞结合，但靶细胞上的特异性受体分子尚未完全阐明。在这里，我们描述了脂质体浮选测定的方案，以定性方式研究RuV颗粒和脂质膜之间的直接相互作用。使用UV-灭活的RuV颗粒和由纯脂质组成的荧光标记的脂质体通过Nycodenz密度梯度分级检查相互作用。使用标准十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测分级的RuV颗粒，然后对病毒蛋白进行Western印迹分析。在Nycodenz梯度上，与未结合的RuV颗粒相比，与脂质体结合的RuV颗粒转移至较低密度的部分。使用该方案，我们提供了令人信服的证据，即在中性pH下以钙依赖性方式，RuV颗粒与某些细胞类型中含有鞘磷脂（SM）和胆固醇的脂质膜结合。
【背景】 风疹病毒是“风疹”的致病因子，“风疹”是一种急性且相对轻微的全身性感染和“先天性风疹综合征”，一种导致严重出生缺陷的转胎胎儿感染（Hobman，2013）。阐明RuV进入的分子机制对于了解病毒病理学和帮助开发抗RuV药物是必不可少的。虽然以前的研究表明宿主细胞的膜脂质作为RuV受体（Mastromarino et al。，1989和1990; DuBois et ...
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