| Primer ID Next-Generation Sequencing for the Analysis of a Broad Spectrum Antiviral Induced Transition Mutations and Errors Rates in a Coronavirus Genome
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Author:
Date:
2021-03-05
[Abstract] Next generations sequencing (NGS) has become an important tool in biomedical research. The Primer ID approach combined with the MiSeq platform overcomes the limitation of PCR errors and reveals the true sampling depth of population sequencing, making it an ideal tool to study mutagenic effects of potential broad-spectrum antivirals on RNA viruses. In this report we describe a protocol using Primer ID sequencing to study the mutations induced by antivirals in a coronavirus genome from an in vitro cell culture model and an in vivo mouse model. Viral RNA or total lung tissue RNA is tagged with Primer ID-containing cDNA primers during the initial reverse transcription step, followed by two rounds of PCR to amplify viral sequences and incorporate sequencing adaptors. Purified and pooled ...
[摘要] [摘要]下一代测序（NGS）已成为生物医学研究的重要工具。结合MiSeq平台的Primer ID方法克服了PCR错误的局限性，并揭示了群体测序的真实采样深度，使其成为研究潜在的广谱抗病毒剂对RNA病毒的诱变作用的理想工具。在本报告中，我们描述了一种使用引物ID测序的方案，用于研究体外细胞培养模型和体内小鼠模型中冠状病毒基因组中抗病毒药诱导的突变。在最初的反转录步骤中，病毒RNA或总肺组织RNA用含Primer ID的cDNA引物标记，然后进行两轮PCR扩增病毒序列并整合测序适配器。使用MiSeq平台对纯化和合并的文库进行测序。测序数据使用模板共有序列（TCS）网络应用处理。引物ID方法提供了一种精确的测序方案，可以测量病毒RNA基因组和宿主mRNA中的突变错误率。测序结果表明，β-D-N4-羟基胞嘧啶核苷（NHC）大大提高了病毒RNA基因组中的过渡取代率，但并未显着提高颠覆取代率，并且发现胞嘧啶（C）至尿苷（U）是最常见的突变。
[背景]下一代测序（NGS）已被广泛应用在生物医学研究中使用在过去十年。当应用NGS研究宿主内病毒种群的RNA病毒时，需要考虑对文库制备和测序方案的修改。样本之间的病毒滴度（或病毒载量）差异很大。传统的NGS平台在测序运行中需要1-500 ng的DNA（或RNA），但在大多数情况下，临床样品中的病毒RNA少于100 ...
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| Tethered Chromosome Conformation Capture Sequencing in Triticeae: A Valuable Tool for Genome Assembly
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Author:
Date:
2018-08-05
[Abstract] Chromosome conformation capture sequencing (Hi-C) is a powerful method to comprehensively interrogate the three-dimensional positioning of chromatin in the nucleus. The development of Hi-C can be traced back to successive increases in the resolution and throughput of chromosome conformation capture (3C) (Dekker et al., 2002). The basic workflow of 3C consists of (i) fixation of intact chromatin, usually by formaldehyde, (ii) cutting the fixed chromatin with a restriction enzyme, (iii) religation of sticky ends under diluted conditions to favor ligations between cross-linked fragments or those between random fragments and (iv) quantifying the number of ligations events between pairs of genomic loci (de Wit and de Laat, 2012). In the original 3C protocol, ligation frequency was ...
[摘要] 染色体构象捕获测序（Hi-C）是一种全面询问细胞核中染色质三维定位的有效方法。 Hi-C的发展可以追溯到染色体构象捕获的分辨率和通量的连续增加（3C）（Dekker et al。，2002）。 3C的基本工作流程包括（i）通常用甲醛固定完整的染色质，（ii）用限制酶切割固定的染色质，（iii）在稀释条件下重新连接粘性末端，以促进交联片段之间的连接或随机片段之间的那些和（iv）量化基因组基因座对之间的连接事件的数量（de Wit和de Laat，2012）。在最初的3C方案中，通过半定量PCR扩增对应于少量基因组位点（“一对一”）的选定连接接头来测量连接频率（Dekker et al。，2002 ）。然后，染色体构象捕获芯片（4C）和染色体构象捕获碳复制（5C）技术扩展3C以分别以“一对多”或“多对多”方式计算结扎事件。 Hi-C（Lieberman-Aiden et al。，2009）最终将3C与下一代测序相结合（Metzker，2010）。此处，在再连接之前，用生物素标记的核苷酸类似物填充粘性末端以在后续步骤中富集具有连接连接的片段。然后对Hi-C文库进行高通量测序，并将得到的读数映射到参考基因组，允许以“多对多”方式确定接触概率，其分辨率仅受限制性位点的分布限制和阅读深度。 Hi-C的首次应用是阐明人类基因组中的全球染色质折叠原理（Lieberman-Aiden et ...
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