| Screening Method for CRISPR/Cas9 Inhibition of a Human DNA Virus: Herpes Simplex Virus
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Author:
Date:
2020-09-05
[Abstract] The efficiency of cleavage of individual CRISPR/Cas9-sgRNAs remains difficult to predict based on the CRISPR target sequence alone. Different intracellular environments (dependent on cell type or cell cycle state for example) may affect sgRNA efficiency by altering accessibility of genomic DNA through DNA modifications such as epigenetic marks and DNA-binding proteins (e.g., histones) as well as alteration of the chromatin state of genomic DNA within the nucleus.
We recently reported a multi-step screening method for the identification of efficient sgRNAs targeting the Herpes simplex virus (HSV-1) genome and reported a differential mechanism for viral inhibition by CRISPR-Cas9 in the latent versus lytic phase. The screening platform detailed in this protocol allows ...
[摘要] [摘要 ] 单独基于CRISPR靶序列仍难以预测单个CRISPR / Cas9-sgRNA的切割效率。不同的细胞内环境（例如，取决于细胞类型或细胞周期状态）可能会通过DNA修饰（例如表观遗传标记和DNA结合蛋白（例如组蛋白））和染色质状态的改变来改变基因组DNA的可及性，从而影响sgRNA效率。核内基因组DNA的标记。
我们recen TLY 报道的多步骤方法筛选用于有效sgRNAs靶向的识别的单纯疱疹病毒（HSV-1）的基因组，并报告为在潜对裂解病毒相抑制CRISPR-Cas9的差动机构。该协议中详述的筛选平台允许在无细胞系统中以及在病毒靶细胞（例如人包皮成纤维细胞）的背景下逐步测试切割效率，然后对CRISPR / sgRNA的作用进行功能测试病毒蛋白的表达，复制，和再活化。该策略可以容易地应用于其他靶细胞，例如多能干细胞衍生的人感觉神经元或其他人DNA病毒。
背景 ] 单纯疱疹病毒（HSV）是的一种嗜神经性DNA病毒疱疹病毒科家族引起终身和无法治愈感染在大多数人群的，并可能导致显著发病率和死亡率（Liesegang环等人，1989; Roizman 等人。，2013） ...
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| Fluorophore-Based Mitochondrial Ca2+ Uptake Assay
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Author:
Date:
2018-07-20
[Abstract] The physiological importance of mitochondrial calcium uptake, observed in processes such as ATP production, intracellular calcium signaling, and apoptosis, makes desirable a simple, straightforward way of investigating this event with unambiguous results. The following protocol uses a calcium-sensitive, membrane-impermeable fluorophore to monitor extra-mitochondrial calcium levels in the presence of permeabilized mammalian cells harboring activated mitochondria.
[摘要] 在诸如ATP产生，细胞内钙信号传导和细胞凋亡的过程中观察到的线粒体钙摄取的生理学重要性使得以明确的结果研究该事件的简单，直接的方式成为可取的。 以下方案使用钙敏感的膜不可渗透的荧光团来监测在具有活化的线粒体的透化的哺乳动物细胞存在下的线粒体外钙水平。
【背景】线粒体钙单向转运蛋白（MCU）介导的钙通量是钙进入线粒体的主要方式。线粒体钙由于几个原因是重要的，其中三个原因经常在文献中引用。其一，线粒体中的钙激活Krebs循环中的关键脱氢酶，导致ATP产生增加。最近的一项研究表明，线粒体钙对F1FO-ATP酶和细胞色素链活性有直接影响（Glancy和Balaban，2012），进一步增强其在细胞能量产生中的关键作用。二，由于MCU的低微摩尔亲和力和大量细胞溶质钙线粒体可以隔离，MCU介导的钙摄取也在清除细胞质钙的瞬时增加中起关键作用，反过来，形成使用钙的细胞信号通路作为第二信使（Wheeler et al。，2012）。三，线粒体钙的调节在细胞凋亡的调节中起重要作用（Zoratti和Szabo，1995）。线粒体钙水平的急剧增加通过诱导内膜中线粒体通透性转换孔的开放而引发细胞死亡，这一事件消除了线粒体内部膜电位并从膜间隙释放细胞色素C，暗黑/ Smac和半胱氨酸蛋白酶（ Zoratti和Szabo，1995; ...
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