| A mant-GDP Dissociation Assay to Compare the Guanine Nucleotide Binding Preference of Small GTPases
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Author:
Date:
2021-01-20
[Abstract] Small GTPases are cellular switches that are switched on when bound to GTP and switched off when bound to GDP. Different small GTPase proteins or those with mutations may bind to GTP or GDP with different relative affinities. However, small GTPases generally have very high affinities for guanine nucleotides, rendering it difficult to compare the relative binding affinities for GTP and GDP. Here we developed a method for comparing the relative binding strength of a protein to GTP and GDP using a mant-GDP dissociation assay, whereby the abilities of GTP and GDP to induce the dissociation of bound mant-GDP are compared. This equilibrium type assay is simple, economic, and much faster than obtaining each protein’s affinity for GDP and GTP. The GDP/GTP preference value obtained is useful ...
[摘要] [摘要]小型GTPases是蜂窝交换机，绑定到GTP时打开，绑定到GDP时关闭。不同的小GTPase蛋白或具有突变的蛋白可能以不同的亲和力与GTP或GDP结合。然而，小的GTP酶通常具有非常高的鸟嘌呤核苷酸亲和力，使得难以比较GTP和GDP的相对结合亲和力。在这里，我们开发了一种方法，使用以下方法比较蛋白质与GTP和GDP的相对结合强度 mant-GDP解离分析，比较了GTP和GDP诱导绑定的mant-GDP解离的能力。这种平衡类型测定简单，经济并且比获得每种蛋白质对GDP和GTP的亲和力要快得多。Ť他GDP / GTP偏好值获得是用于比较的相对GTP有用/ GDP结合偏好小号不同GTP酶或不同的突变体，尽管这不是真正的GDP / GTP亲和力比（而是比的估计）。
[背景]小GTP酶（也称为小G蛋白）是一组功能上重要的大分子，由于其固有的水解酶活性，它们可以与GTP结合并水解为GDP 。在人类，米矿比一百种不同的小GTP酶分为五个家庭，即RAS，卢，冉，拉布和Arf的，根据其序列，结构，和功能（Wennerberg等，2005） 。
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| α-Synuclein Aggregation Monitored by Thioflavin T Fluorescence Assay
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Author:
Date:
2018-07-20
[Abstract] Studying the aggregation of amyloid proteins like α-synuclein in vitro is a convenient and popular tool to gain kinetic insights into aggregation as well as to study factors (e.g., aggregation inhibitors) that influence it. These aggregation assays typically make use of the fluorescence dye Thioflavin T as a sensitive fluorescence reporter of amyloid fibril formation and are conducted in a plate-reader-based format, permitting the simultaneous screening of multiple samples and conditions. However, aggregation assays are generally prone to poor reproducibility due to the stochastic nature of fibril nucleation and the multiplicity of modulating factors. Here we present a simple and reproducible protocol to study the aggregation of α-synuclein in a plate-reader based assay.
[摘要] 研究淀粉样蛋白如α-突触核蛋白体外聚集是一种方便和流行的工具，可以获得聚集的动力学见解以及研究因子（例如，聚集抑制剂） 影响它。 这些聚集测定通常利用荧光染料硫磺素T作为淀粉样蛋白原纤维形成的敏感荧光报告物，并且以基于读板器的形式进行，允许同时筛选多个样品和条件。 然而，由于原纤维成核的随机性质和调节因子的多样性，聚集测定通常倾向于较差的再现性。 在这里，我们提出了一个简单和可重复的协议，以研究基于读板器的测定中α-突触核蛋白的聚集。
【背景】内源性蛋白质与淀粉样原纤维的聚集是一种致病过程，与几种疾病相关，例如，神经退行性疾病如阿尔茨海默病（AD）或帕金森病（PD）以及全身性疾病如AL淀粉样变性（ Knowles et al。，2014）。通过基于硫磺素T荧光的聚集测定，可以在基于板读者的装置中在体外中概括该过程，从而允许根据各种影响因素研究淀粉样蛋白的聚集动力学。
硫磺素T（ThT）是一种荧光染料，最初用于组织学样本中的淀粉样蛋白原纤维染色，于1959年由Vassar和Culling（Vassar和Culling，1959），其在体外检测和定量淀粉样纤维的应用
目前，硫代黄素T的聚集测定主要在荧光板读数器中进行，其中例如，96条件可以同时测试。由于原纤维成核的随机性质和影响蛋白质聚集的多种因素，这些测定法具有较差的重现性。因此，已经采用了增加ThT测定的再现性的策略，例如在测量期间使用井板的轨道摇动以及向孔中添加玻璃珠以改善混合（Giehm和Otzen，2010）。 ...
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