| Ex vivo Assessment of Mitochondrial Function in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using XF Analyzer
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Author:
Date:
2021-04-05
[Abstract] Cellular health and function, as we know today, depend on a large extent on mitochondrial function. The essential function of mitochondria is the energy production, more precisely ATP production, via oxidative phosphorylation. Mitochondrial energy production parameters therefore represent important biomarkers. Studies on human cells have mainly been performed on in vitro cell cultures. However, peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are particularly suitable for such examinations. That’s why this protocol describes a method to measure key parameters of mitochondrial function in freshly isolated PBMCs with the latest technology, the XF Analyzer. For this ex vivo approach PBMCs are first isolated out of human anticoagulated blood. Next, they are attached to the surface of special ...
[摘要] [摘要]正如我们今天所知，细胞的健康和功能在很大程度上取决于线粒体的功能。线粒体的基本功能是ENER GY生产，更精确的LY ATP生产，通过氧化磷酸化。因此，线粒体能量产生参数代表重要的生物标记。对人类细胞的研究主要是在体外细胞培养中进行的。然而，外周血单核细胞（PBMC）是特别升ý适于这样的检查。这就是为什么这个协议描述测量与最新的技术，新鲜分离的PBMC线粒体功能的关键参数的方法的XF分析。对于这个离体PBMC首先是从人抗凝血液中分离出来的。接下来，将它们附着到预先涂有Poly-D-Lysine的特殊微孔板的表面上。期间的氧消耗速率（OCR）以及细胞外酸化率（ECAR）的应力试剂寡，羰氰化物随后的测量4 - （三氟甲氧基）苯腙（FCCP），鱼藤酮和抗霉素A被注入。可以从获得的结果中计算出几个线粒体参数。该协议的应用允许分析对人体细胞的各种影响，例如药物或环境因素。
[背景]线粒体在维持正常细胞功能中起关键作用。现在众所周知，它们不仅通过氧化磷酸化产生ATP，而且还参与氨基酸，脂质和核苷酸的代谢，潜水信号转导和氧化还原过程以及质量控制和降解过程，包括线粒体和磷酸化。细胞凋亡（Pfanner等，2019）。然而，线粒体代表正常细胞中ATP合成的主要位点（Akbari等人，2019）。为此，通过多亚基酶复合物I – ...
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| Immuno-electrophysiology on Neuromuscular Junctions of Drosophila Third Instar Larva
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Author:
Date:
2021-02-05
[Abstract] Alterations in synaptic transmission are critical early events in neuromuscular disorders. However, reliable methodologies to analyze the functional organization of the neuromuscular synapses are still needed. This manuscript provides a detailed protocol to analyze the molecular assembly of the neuromuscular synapses through immune-electrophysiology in Drosophila melanogaster. This technique allows the quantification of the molecular behavior of the neuromuscular synapses by correlating the structural configuration of the synaptic boutons with their electrical activity.
[摘要] [摘要]突触传递的改变是神经肌肉疾病的关键早期事件。但是，仍然需要可靠的方法来分析神经肌肉突触的功能组织。此马努脚本提供了详细的协议，通过在免疫电分析神经肌肉突触的分子组装果蝇黑腹果蝇。该技术通过使突触钮扣的结构构型与其电活动相关联，可以量化神经肌肉突触的分子行为。
[背景]果蝇三龄幼虫的神经肌肉接头（NMJ）的功能组织在研究突触形成和功能的分子机制方面具有突出的优势（Feiguin等，2009 ; Godena等，2011; Romano等。（2014年和2015年；Strah等人，2020年），它在包括人类在内的其他物种中似乎是保守的。在这方面，果蝇NMJs的解剖组织是由多个突触钮扣构成的，这些突触钮扣是在运动轴突的最终乔木形成的。这些结构的分化和维持负责骨骼肌的神经支配，并暗示不同分子的协调作用，专门用于建立细胞接触以及释放，接收和整合神经递质信号传导所需的机制。此外，在果蝇中开发的功能强大的遗传工具以及神经系统对单个神经元的解剖学解析，提供了难得的机会，可以在可区分细胞的组织中进行全基因组范围的分子表型无偏搜索。尽管果蝇已经存在可视化神经肌肉突触建立的单独协议（Sabeva和Bykhovskaia，2017 ; Goel等人，2019 ...
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| Confocal and Super-resolution Imaging of RNA in Live Bacteria Using a Fluorogenic Silicon Rhodamine-binding Aptamer
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Author:
Date:
2020-05-05
[Abstract] Genetically encoded light-up RNA aptamers have been shown to be promising tools for the visualization of RNAs in living cells, helping us to advance our understanding of the broad and complex life of RNA. Although a handful of light-up aptamers spanning the visible wavelength region have been developed, none of them have yet been reported to be compatible with advanced super-resolution techniques, mainly due to poor photophysical properties of their small-molecule fluorogens. Here, we describe a detailed protocol for fluorescence microscopy of mRNA in live bacteria using the recently reported fluorogenic silicon rhodamine binding aptamer (SiRA) featuring excellent photophysical properties. Notably, with SiRA, we demonstrated the first aptamer-based RNA visualization using super-resolution ...
[摘要] [摘要 ] 遗传编码的点亮适体是显示活细胞中RNA的有前途的工具，可帮助我们加深对RNA广泛而复杂的生命的理解。可见光波长区已经被开发，他们都没有然而，据报道，在兼容先进的超分辨率技术，主要是由于不良的光物理性质其小分子荧光团。在这里，我们描述了一个详细的协议对于荧光显微镜mRNA的使用最近报道的具有优异光物理性质的荧光罗丹明结合适体（SiRA ）在活细菌中进行检测。值得注意的是，我们利用SiRA 展示了首个使用超分辨率（STED）显微镜进行的基于适体的RNA可视化。这种成像方法可能特别有价值用于可视化原核生物中的RNA，因为细菌的大小仅比光学分辨率大几倍 传统显微镜的分辨率。
[背景 ] 可视化的具体RNA分子通过荧光显微镜具有不可估量的价值在过去二十年中扩大我们的知识RNA功能内的细胞在时空精气神（特亚吉，2009年;夏等人，2017年），由于缺乏。固有的荧光RNA，用于活细胞成像的荧光RNA标记工具的开发以及它们对最新显微镜的适应性 –特别是对于超分辨率显微镜– 势在必行。超分辨率显微镜（SRM）对于原核系统中的RNA成像特别有吸引力，因为细菌很小（〜2.5MYU中号长，0.5-1〜MYU 中号宽）和分辨率的标准荧光显微镜被限制在200〜300〜牛米，由于衍射极限光（Reshes ...
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