| In vitro Enzymatic Assays of Histone Decrotonylation on Recombinant Histones
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Author:
Date:
2018-07-20
[Abstract] Class I histone deacetylases (HDACs) are efficient histone decrotonylases, broadening the enzymatic spectrum of these important (epi-)genome regulators and drug targets. Here, we describe an in vitro approach to assaying class I HDACs with different acyl-histone substrates, including crotonylated histones and expand this to examine the effect of inhibitors and estimate kinetic constants.
[摘要] I类组蛋白去乙酰化酶（HDACs）是有效的组蛋白去蛋白酶，拓宽了这些重要（epi-）基因组调节因子和药物靶标的酶谱。 在这里，我们描述了一种体外方法来测定具有不同酰基 - 组蛋白底物的I类HDAC，包括巴豆酰化组蛋白，并将其扩展以检查抑制剂的作用并估计动力学常数。
【背景】组蛋白的翻译后修饰是基因组调控的重要方面，包括基因表达（例如参见Pengelly et al。，2013;在Castillo 等人中综述，2017）。组蛋白修饰改变染色质结构和/或调节蛋白质的结合，例如核小体重塑因子（在Bannister和Kouzarides，2011中综述）。大多数组蛋白修饰是可逆的并且可以酶促去除。例如，通过组蛋白脱乙酰基酶（HDAC）除去组蛋白乙酰化，其中存在几类。近年来，新的组蛋白赖氨酸酰化，包括琥珀酰化，丙酰化，丁酰化，羟基丁基化和巴豆酰化已成为规范组蛋白乙酰化的新替代物，并且已经证实了许多这些新发现的组蛋白修饰的功能相关性（Sabari 等人，2017）。特别是，组蛋白巴豆酰化与活性基因表达有关，并被认为受细胞代谢状态的影响（Sabari et al。，2015; Fellows et al。 ，2018年）。最近已显示I类组蛋白脱乙酰酶也有效地去除组蛋白质（Wei et al。，2017; Fellows et al。，2018）。
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| In vitro Chaperone Activity Assay Using α-Amylase as Target Protein
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Author:
Date:
2018-06-20
[Abstract] Small heat shock proteins (sHSP) are stress proteins which are ubiquitously found in almost all living organisms. They function as molecular chaperones, which assist in protein folding during translation and in the prevention of irreversible protein aggregation under denaturing conditions. This protocol describes the use of α-amylase as target protein in assessing the chaperone activity of wild and mutant recombinant small heat shock proteins of Mycobacterium leprae. Chaperone activity of these proteins, along with α-crystallin, a standard sHSP was demonstrated using a new method employing their protective effect against heat denaturation of α-amylase from porcine pancreas. The regained enzymatic activity of the α-amylase was demonstrated on starch agar plates stained with ...
[摘要] 小热休克蛋白（sHSP）是在几乎所有生物体中无处不在发现的应激蛋白。 它们作为分子伴侣起作用，这有助于在翻译过程中蛋白质折叠以及在变性条件下预防不可逆的蛋白质聚集。 该协议描述了使用α-淀粉酶作为靶蛋白来评估麻风分枝杆菌的野生和突变重组小热休克蛋白的分子伴侣活性。 这些蛋白质的陪伴分子活性以及标准sHSP的α-晶状体蛋白通过采用其对猪胰α-淀粉酶的热变性的保护作用的新方法被证实。 在用碘 - 碘化钾（I 2 -KI）溶液染色的淀粉琼脂平板上证实α-淀粉酶的重新酶活性。
【背景】热休克蛋白（HSPs）是一组保守的蛋白质，当细胞暴露于外部应激（包括热应激和冷应激）时诱导蛋白质。该组中的大多数成员在功能上与蛋白质折叠和解折叠机制有关。小热休克蛋白（sHSPs）是热休克蛋白的子集，其分子大小为12至43kDa，并且保守的C末端区域称为'α-晶域'。 sHSP通过与部分未折叠的蛋白结合并阻止其完全变性而显示ATP非依赖性分子伴侣活性。有几种用于证明sHSPs的体外伴侣蛋白活性的方法，其使用各种底物蛋白如RuBisCO（Goloubinoff等人，1989），rhodanese（Mendoza等人（Farahbakhsh等，1995），溶菌酶（Rozema和Gellman，1996），苹果酸脱氢酶（Lee等， ...
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