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Date:
2018-06-20
[Abstract] The protocol described here has been developed to detect RNA at the single cell level. Fluorescent probes hybridize to target RNAs and are detected by flow cytometry after multiple amplification steps. Different types of RNA can be detected such as mRNA, long noncoding RNA, viral RNA or telomere RNA and up to 4 different target probes can be used simultaneously. We used this protocol to specifically measure the expression of two transcription factor mRNAs, MAFB and IRF4, in human monocytes.
[摘要] 这里描述的方案已经被开发用于在单细胞水平上检测RNA。 荧光探针与目标RNA杂交，并在多个扩增步骤后通过流式细胞术检测。 可以检测不同类型的RNA，例如mRNA，长的非编码RNA，病毒RNA或端粒RNA，并且可以同时使用多达4种不同的靶探针。 我们使用该方案来特异性测量人单核细胞中两种转录因子mRNA，MAFB和IRF4的表达。
【背景】RT-qPCR是用于轻松评估RNA表达的一种主要技术。将细胞裂解并批量分析。因此，细胞异质性丧失。特别是，使用RT-qPCR来解决是否可以基于RNA的表达来鉴定亚群是不可能的。 RNA荧光原位杂交（FISH）是一种检测单细胞RNA的方法。该技术需要RNA靶标上的荧光探针杂交，然后使用成像系统如共聚焦显微镜检测。但是，这种方法非常耗时，并且可以分析有限数量的单个细胞。
我们通过RT-qPCR证实，在具有M-CSF，IL-4和TNFα的RPMI中培养的人单核细胞在三小时后表达转录因子MAFB和IRF4（Goudot等人，2017）。 MAFB和IRF4分别参与单核细胞向单核细胞衍生的巨噬细胞（mo-mac）和单核细胞衍生的DC（mo-DC）的分化。为了破译单核细胞是否表达两种转录因子，或者如果这种表达是互斥的，我们使用PrimeFlow RNA测定法进行与流式细胞术偶联的原位杂交。
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