| Cell-free Reconstitution of the Packaging of Cargo Proteins into Vesicles at the trans Golgi Network
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Author:
Date:
2020-03-05
[Abstract] Protein sorting at the trans Golgi network (TGN) plays important roles in targeting newly synthesized proteins to their specific destinations. The aim of this proposal is to reconstitute the packaging of non-Golgi resident cargo proteins into vesicles at the TGN, utilizing rat liver cytosol, semi-intact mammalian cells and nucleotides. The protocol describes how to perform the vesicle formation assay, how to isolate vesicles and how to detect cargo proteins in vesicles. This reconstitution assay can be used to quantitatively measure the efficiency of the packaging of a specific cargo protein into transport vesicles at the TGN under specific experimental conditions.
[摘要] [摘要] 反式高尔基体网络（TGN）上的蛋白质分选在将新合成的蛋白质靶向其特定目的地方面起着重要作用。该提议的目的是利用大鼠肝细胞溶质，半完整的哺乳动物细胞和核苷酸，在TGN处将非高尔基驻留的货物蛋白重新包装成囊泡。该协议描述了如何进行囊泡形成测定，如何分离囊泡以及如何检测囊泡中的货物蛋白。该重构测定法可用于定量测量在特定实验条件下将特定货物蛋白包装到TGN的运输小泡中的效率。
[背景] 的反式高尔基体网络（TGN）是在分泌运送路径的必要的交通枢纽。为了确保水泡运输的保真度，真核细胞利用各种蛋白质分选设备将特定的货物蛋白质准确地包装到TGN的运输小泡中，然后运至特定的目的地（Guo 等人，2014）。为了加深我们对TGN分选过程特异性的理解，重要的是开发一种能够忠实地重构TGN囊泡形成和货物分选过程的分析方法。该测定法可用于直接和定量地测量特定因子在调节特定货物蛋白包装到运输小泡中的作用。从内质网（ER）将货物蛋白包装到COPII囊泡中的无细胞重构已得到很好的建立（Kim 等，2005; Kim 等，2007; Merte 等，2010; Yuan 等。，2018；Niu 等，2019；）。已经开发出一种体外测定法，其在TGN处重构特定货物蛋白TGN46在运输小泡中的释放（Ponnambalam 等，1996；Wakana ...
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| Fluorophore-Based Mitochondrial Ca2+ Uptake Assay
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Author:
Date:
2018-07-20
[Abstract] The physiological importance of mitochondrial calcium uptake, observed in processes such as ATP production, intracellular calcium signaling, and apoptosis, makes desirable a simple, straightforward way of investigating this event with unambiguous results. The following protocol uses a calcium-sensitive, membrane-impermeable fluorophore to monitor extra-mitochondrial calcium levels in the presence of permeabilized mammalian cells harboring activated mitochondria.
[摘要] 在诸如ATP产生，细胞内钙信号传导和细胞凋亡的过程中观察到的线粒体钙摄取的生理学重要性使得以明确的结果研究该事件的简单，直接的方式成为可取的。 以下方案使用钙敏感的膜不可渗透的荧光团来监测在具有活化的线粒体的透化的哺乳动物细胞存在下的线粒体外钙水平。
【背景】线粒体钙单向转运蛋白（MCU）介导的钙通量是钙进入线粒体的主要方式。线粒体钙由于几个原因是重要的，其中三个原因经常在文献中引用。其一，线粒体中的钙激活Krebs循环中的关键脱氢酶，导致ATP产生增加。最近的一项研究表明，线粒体钙对F1FO-ATP酶和细胞色素链活性有直接影响（Glancy和Balaban，2012），进一步增强其在细胞能量产生中的关键作用。二，由于MCU的低微摩尔亲和力和大量细胞溶质钙线粒体可以隔离，MCU介导的钙摄取也在清除细胞质钙的瞬时增加中起关键作用，反过来，形成使用钙的细胞信号通路作为第二信使（Wheeler et al。，2012）。三，线粒体钙的调节在细胞凋亡的调节中起重要作用（Zoratti和Szabo，1995）。线粒体钙水平的急剧增加通过诱导内膜中线粒体通透性转换孔的开放而引发细胞死亡，这一事件消除了线粒体内部膜电位并从膜间隙释放细胞色素C，暗黑/ Smac和半胱氨酸蛋白酶（ Zoratti和Szabo，1995; ...
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| Cell-free Generation of COPII-coated Procollagen I Carriers
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Author:
Date:
2017-11-20
[Abstract] The aim of this protocol is to generate COPII-coated procollagen I (PC1) carriers in a cell-free reaction. The COPII-coated PC1 carriers were reconstituted from donor membrane, cytosol, purified recombinant COPII proteins, and nucleotides. This protocol describes the preparation of donor membrane and cytosol, the assembly of the reaction, and the isolation and detection of reconstituted COPII-coated carriers. This cell-free reaction can be used to test conditions that stimulate or suppress the packaging of PC1 into COPII-coated carriers.
[摘要] 该协议的目的是在无细胞反应中产生COPII包被的前胶原I（PC1）载体。 COPII包被的PC1载体由供体膜，胞质溶胶，纯化的重组COPII蛋白和核苷酸重构。 该方案描述了供体膜和细胞溶胶的制备，反应的组装，以及复制的COPII包被的载体的分离和检测。 该无细胞反应可用于测试刺激或抑制PC1包装成COPII包被的载体的条件。
【背景】外壳蛋白复合体II（COPII）在从内质网（ER）途径到高尔基体的运输中起着至关重要的作用。来自ER的货物运输所需的基因在酵母的基因研究中被发现，并且借助于添加有纯化组分的无细胞囊泡萌芽反应来阐明囊泡出芽所需基因的蛋白质产物的精确作用（Novick 1981; Kaiser等人，1990; Barlowe等人，1994）。开发了类似的反应来检测COPII在培养的哺乳动物细胞中来自ER的货物运输中的作用（Kim等人，2005）。哺乳动物COPII包被的囊泡直径大约为80-100nm，似乎太小以至于不能容纳诸如刚性的300nm前胶原I（PC1）三股螺旋杆的大分泌性货物。尽管可能的尺寸差异，COPII对于包括PC1在内的大型货物的分泌是必不可少的（Boyadjiev等人，2006）。最近，我们报道了通过随机光学重建显微镜（STORM），相关光电子显微镜（CLEM）和活细胞成像（Gorur ...
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