| A Quantitative Assay to Measure Stress Granule Association of Proteins and Peptides in Semi-permeabilized Human Cells
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Author:
Date:
2020-12-20
[Abstract] Stress granules (SGs) are membrane-less organelles that form in the cytoplasm through phase separation, in response to diverse stressors. SGs contain translationally stalled mRNAs, proteins involved in translation, and various RNA-binding proteins (RBPs). Due to the high local concentration of aggregation-prone RBPs, SGs might act as condensation sites for aberrant phase transitions of RBPs and could favor formation of solid protein aggregates underlying the pathological cytoplasmic inclusions found in numerous neurodegenerative diseases. Most assays aiming at studying the recruitment of RBPs into SGs are based on overexpression and SG recruitment of RBPs in intact cells. These approaches are, however, often limited by the predominantly nuclear localization of many RBPs, which precludes ...
[摘要] [摘要]圣RESS颗粒剂（SGS）是膜较少细胞器形式在通过相分离细胞质中，响应于不同的压力源。SG包含翻译停滞的mRNA，翻译中涉及的蛋白和各种RNA结合蛋白（RBP）。由于易于凝集的RBP的局部浓度很高，SG可能充当RBP异常相变的缩合位点，并且可能有助于形成在许多神经退行性疾病中发现的病理性细胞质内含物的固体蛋白质聚集体。大多数分析瞄准荷兰国际集团在研究限制性商业惯例的招募SG的基础上表达和SG招聘完整细胞的限制性商业惯例。但是，这些方法通常受到许多RBP的主要核定位的限制，这排除了足以进行SG定位的细胞质RBP浓度，并且没有解决独立于SG形成的RBP募集问题。在这里，我们提出了一个定量的方法来评估重组限制性商业惯例的募集至预先形成的SG，独立于RBP的核定位，用半透细胞和荧光显微镜。在该测定中，SG被第一LY由应激诱导的，然后第质膜ë应激的细胞随后被选择性地透化，以提供重组蛋白的访问的SG。通过用小麦胚芽凝集素阻塞核孔来阻止目的蛋白的核输入。这种测定方法使人们能够定量研究在没有核导入且在受控条件下将RBP募集到SG中的分子机制。该方法允许对野生型，突变体或直接比较翻译后修饰的限制性商业惯例，用于解决第其它蛋白质电子影响“预防或促进限制性商业惯例的SG关联，并且也适用于合成的肽。
图形摘要：
工作流概述在半SG招募重组蛋白质或肽的分析透化细胞 ...
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| Expansion of Airway Basal Cells and Generation of Polarized Epithelium
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Author:
Date:
2018-06-05
[Abstract] Airway basal stem cells are the progenitor cells within the airway that exhibit the capacity to self-renew and give rise to multiple types of differentiated airway epithelial cells. This stem cell-derived epithelium displays organized architecture with functional attributes of the airway mucosa. A protocol has been developed to culture and expand human airway basal stem cells while preserving their stem cell properties and capacity for subsequent mucociliary differentiation. This achievement presents a previously unrealized opportunity to maintain a durable supply of progenitor cells derived from healthy donors to differentiate into human primary airway epithelium for cellular and molecular-based studies. Further, basal stem cells can be harvested from patients with a specific airway ...
[摘要] 气道基底干细胞是气道内的祖细胞，表现出自我更新的能力并产生多种类型的分化的气道上皮细胞。这种干细胞来源的上皮细胞显示出具有气道粘膜功能属性的有组织的结构。已经开发了一种方案来培养和扩展人气道基底干细胞，同时保持其干细胞特性和后续粘液分泌的能力。这项成就提供了一个以前未实现的机会，以保持源自健康供体的祖细胞的持久供应，以分化为用于基于细胞和分子的研究的人原发性气道上皮。此外，基底干细胞可以从患有特定气道疾病的患者（例如囊性纤维化）中收集，从而能够在适当的气道粘膜环境下研究疾病特异性细胞的潜在改变的行为。在这里，我们详细描述了一系列气道基底干细胞系列扩增的方案，以实现几乎无限制的气道基底细胞的生成，这些细胞可以储存并随时用于随后的培养和分化。此外，我们描述了气液基底干细胞在空气 - 液体界面处的可渗透Transwell过滤器上的培养和分化，以创建功能性粘膜睫毛伪分层极化气道上皮粘膜。
【背景】气道疾病建模和药物发现已经从在气液界面（ALI）的可渗透Transwell过滤器上生长的原代呼吸道上皮培养物的开发和使用中获益。与永生化细胞系相比，该模型具有几个优点，即原代上皮细胞可以分化成具有多种上皮细胞类型（包括纤毛，浆膜和基底细胞）的气道粘膜，并且它们的排列在体内是相当反映的蜂窝组织。主要的ALI模型表现出功能性微生理过程，包括跳动纤毛和分泌粘液的能力，这些特征在细胞系衍生的上皮单层中显着不存在。此外，原代细胞不依赖于人工永生化或转化，因为细胞系来源的上皮细胞确实存在，因此不受细胞系中可能发生的错误信号传导的阻碍，这可能会错误地表示气道上皮中发生的过程。尽管有这些显着的限制，永生化细胞系被广泛用于模拟和研究气道上皮细胞，因为原发性气道上皮细胞存在自己的一系列挑战。原代上皮细胞在传代数次后无法复制，必须连续收获并分离以完成每组研究。另外，改变或缺失感兴趣基因表达的分子生物学技术难以实现，并且与原代上皮细胞一起维持。这些缺点造成成本和技术障碍，阻碍了原发性ALI培养物的广泛使用，尽管它们在调查气道粘膜方面有明显优势。 ...
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