Ribosome Purification from an α-proteobacterium and rRNA Analysis by Northern Blot
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Author:
Date:
2020-12-05
[Abstract] Ribosomes are an integral part of cellular life. They are complex molecular machines consisting of multiple ribosomal proteins and RNAs. To study different aspects of ribosome composition, many methods have been developed over the decades. Here, we describe how to purify ribosomes from the α-proteobacterium Rhodopseudomonas palustris. Following this protocol, RNA can be extracted from either purified ribosomes or directly from cell cultures, and ribosomal RNAs quantified using Northern blot. This protocol gives an example of studying ribosomes in a bacterium other than the commonly used E. coli. The challenge of performing Northern blots with rRNA is also addressed in detail.
[摘要] [摘要]核糖体是细胞生命的组成部分。它们是由多种核糖体蛋白和RNA组成的复杂分子机器。为了研究核糖体组成的不同方面,几十年来已经开发了许多方法。在这里,我们描述如何从α-变形杆菌Rhodopseudomonas palustris中纯化核糖体。按照该协议,可以从纯化的核糖体中提取RNA,也可以直接从细胞培养物中提取RNA,并使用Northern印迹对核糖体RNA进行定量。该协议给出了研究除常用大肠杆菌外的细菌中核糖体的一个例子。还详细介绍了使用rRNA进行Northern杂交的挑战。
[背景]细菌细胞的命运是紧密相连的核糖体。我们最近的研究表明,活性核糖体在营养缺乏的palustris细胞的存活机制中起着重要作用(Yin等人,2019)。核糖体通过一系列超速离心纯化,并采用经典方法优化的方法(Lawrence等,2016)。使用不太常用的毛细管转移系统,通过RNA印迹检测核糖体RNA群体。纯化步骤的细节可能极大地影响核糖体的状态。这些方法在这里进行了详细描述,对于研究多种细菌中的翻译设备的研究人员应该具有广泛的兴趣。
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Analyzing (Re)Capping of mRNA Using Transcript Specific 5' End Sequencing
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Author:
Date:
2020-10-20
[Abstract] The 5′ cap is a ubiquitous feature of eukaryotic mRNAs. It is added in the nucleus onto newly synthesized pre-mRNA, and in the cytoplasm onto mRNAs after decapping or endonuclease cleavage. Cytoplasmic recapping can occur after loss of the cap at the native 5′ end, or downstream within the body of the mRNA. The identification and location of recapping events is key to understanding the functional consequences of this process. Here we present an approach that addresses this problem, using the Lexogen TeloPrime® cDNA synthesis kit to tag recapped 5′ ends. TeloPrime uses a proprietary DNA ligase to add a double stranded DNA oligonucleotide onto the 3′ end of cDNA while it is base paired with mRNA. Specificity for capped ends is obtained by the oligonucleotide having an unpaired C ...
[摘要] [摘要]5′cap是真核mRNAs普遍存在的特征。它被添加到新合成的pre-mRNA的细胞核中,并在去盖或核酸内切酶切割后加入到mRNAs的细胞质中。细胞质重拾可发生在5′端或mRNA体下游的cap缺失后。识别和定位重述事件是理解该过程的功能后果的关键。这里我们提出了一种解决这个问题的方法,使用Lexogen TeloPrime®cDNA合成试剂盒来标记重述的5′端。TeloPrime使用一种专有的DNA连接酶,在cDNA的3′端加入一个双链DNA寡核苷酸,同时与mRNA碱基配对。寡核苷酸在mRNA 5′端有一个与m7G弱碱基配对的不成对C残基。然后用引物对附加的寡核苷酸和感兴趣的mRNA进行双链cDNA的PCR扩增。得到的产物是凝胶纯化和直接测序(如果是单个带)或克隆和测序。连接的寡核苷酸和靶mRNA连接处的序列提供了cap在相应转录物上的位置。此方法适用于所有封顶转录本。它可以与Sanger测序一起用于少量的转录物,也可以用于Illumina库测序。 [背景]N7-甲基鸟苷帽是所有真核mRNAs的一个显著特征。与cap结合的蛋白质在mRNA生命周期的各个阶段发挥作用,包括核加工、输出、翻译和mRNA衰变。5′cap以共转录方式添加到所有mRNAs中,并开发了许多全基因组技术(例如,基因表达的Capped分析,或CAGE)(Morioka等人,2020年),这些技术利用末端末端的鉴定来标记转录起始位点。除了标记转录起始位点外,约25%的笼状标签映射到剪接内含子的下游(Djebali等人,2012年)。生物化学基础的证据来自我们实验室2009年的鉴定:一种细胞质复合体能够将N7甲基鸟苷帽恢复到5′-单磷酸末端的转录物上,但不能恢复到5′-羟基末端的转录物上(Otsuka等人,2009年)。细胞质封顶由一种复合酶催化,包括封盖酶(RNGTT)、帽甲基转移酶(RNMT)及其激活亚单位(RAM),以及一种将去盖转录物的5′-单磷酸末端转化为5′-二磷酸底物以进行GMP添加的激酶(Trotman和Schoenberg,2019)。我们的早期工作是基于在GMP添加步骤中阻断细胞质封盖的显性负型封盖酶的使用。该蛋白的表达导致出现许多未封顶的转录本,其末端使用5'-种族定位到下游笼状标签附近(Kiss等人,2015年;Berger等人,2019年)。虽然令人鼓舞,但这种方法有三个主要缺点:a)它需要分离带帽和未封顶的rna,b)它假设未封顶的转录本保持足够稳定,可以被检测到,以及c)它假设以这种方式检测到的未封顶末端经历了有限的额外的核外溶核修剪。 ...
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Preparation of Sequencing RNA Libraries through Chemical Cross-linking Coupled to Affinity Purification (cCLAP) in Saccharomyces cerevisiae
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2018-10-05
[Abstract] Ribonucleoprotein particles (mRNPs) are complexes consisting of mRNAs and RNA-binding proteins (RBPs) which control mRNA transcription localization, turnover, and translation. Some mRNAs within the mRNPs have been shown to undergo degradation or storage. Those transcripts can lack general mRNA elements, like the poly(A) tail or 5’ cap structure, which prevent their identification through the application of widely-used approaches like oligo(dT) purification. Here, we describe a modified cross-linking affinity purification protocol (cCLAP) based on existing cross-linking and immunoprecipitation (CLIP) methods to isolate mRNAs which could be deadenylated, decapped and/or partially degraded in mRNPs, opening the possibility to detect different types of non-coding RNAs (ncRNAs). Once isolated, ...
[摘要] 核糖核蛋白颗粒(mRNP)是由mRNA和RNA结合蛋白(RBP)组成的复合物,其控制mRNA转录定位,转换和翻译。已显示mRNP内的一些mRNA经历降解或储存。那些转录物可能缺乏一般的mRNA元件,如poly(A)尾或5'帽结构,这通过应用广泛使用的方法如oligo(dT)纯化来阻止它们的鉴定。在这里,我们描述了基于现有的交联和免疫沉淀(CLIP)方法的修饰的交联亲和纯化方案(cCLAP),以分离mRNP中可被去腺苷酸化,去除和/或部分降解的mRNA,从而开启了检测不同的可能性。非编码RNA(ncRNA)的类型。分离后,将RNA进行衔接子连接,然后进行下一代测序(NGS)。由于快速有效的交联和淬灭步骤,该方案也适用于瞬时诱导的mRNP颗粒。实例包括由外在应激物触发的处理体(PB)或应力颗粒(SG)。其重现性和广泛应用使该方案成为研究特定RNP的RNA组成的有用且有力的工具。 【背景】mRNP内转录物的表征对于理解细胞转录和转录后过程至关重要。通过交联和免疫沉淀,然后通过RNA-Seq从mRNP颗粒中分离RNA已经成为鉴定mRNA靶标的常用方法(Tagwerker et al。,2006; Hafner et al。,2010; Kishore et al。,2011)。 ...
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