| Advances in Proximity Ligation in situ Hybridization (PLISH)
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Author:
Date:
2020-11-05
[Abstract] Understanding tissues in the context of development, maintenance and disease requires determining the molecular profiles of individual cells within their native in vivo spatial context. We developed a Proximity Ligation in situ Hybridization technology (PLISH) that enables quantitative measurement of single cell gene expression in intact tissues, which we have now updated. By recording spatial information for every profiled cell, PLISH enables retrospective mapping of distinct cell classes and inference of their in vivo interactions. PLISH has high sensitivity, specificity and signal to noise ratio. It is also rapid, scalable, and does not require expertise in molecular biology so it can be easily adopted by basic and clinical researchers.
[摘要] [摘要]在发育，维持和疾病的背景下了解组织需要确定单个细胞在其天然体内空间范围内的分子谱。我们开发了一种邻近连接原位杂交技术（PLISH），该技术能够定量测量完整组织中单细胞基因的表达，现已更新。通过记录每个分析细胞的空间信息，PLISH可以回顾性绘制不同细胞类别并推断其体内 互动。PLISH具有很高的灵敏度，特异性和信噪比。它也快速，可扩展，并且不需要分子生物学方面的专门知识，因此基础和临床研究人员可以轻松地采用它。
[背景技术]我们最近开发了一种复用原位称为PLISH（邻位连接杂交技术原位杂交）（Nagendran等人，2018）。PLISH与其他现有的空间转录组学技术不同，因为它结合了高性能，快速多路复用，低成本和技术简单性（Wilbrey -Clark等人，2020年）。可以通过自动计算完整的冷冻或石蜡包埋组织中单细胞表达图谱来分析PLISH结果，它与同时进行的免疫染色兼容。
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| Identification of Buffer Conditions for Optimal Thermostability and Solubility of Herpesviral Protein UL37 Using the Thermofluor Assay
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Author:
Date:
2020-06-20
[Abstract] Structural and biochemical studies of proteins require high amounts of stable, purified proteins. Protein stability often depends on the buffer composition, which includes pH and concentration of salts or other solutes such as glycerol, hence an efficient method for identifying optimal buffer conditions for stability would minimize time and resources used for protein purification and further studies. This protocol describes the use of the Thermofluor assay, in combination with a custom 24-condition screen, to identify buffer conditions that increase protein thermostability, using the conserved herpesviral protein UL37 as an example. Detailed instructions on screen conditions, running the Thermofluor MATLAB script, and analyzing the data are provided. In comparison to circular dichroism ...
[摘要] [摘要]蛋白质的结构和生化研究需要大量稳定、纯化的蛋白质。蛋白质的稳定性通常取决于缓冲液的组成，其中包括pH值和盐或其他溶质（如甘油）的浓度，因此，确定最佳缓冲液稳定性条件的有效方法可以将用于蛋白质纯化和进一步研究的时间和资源减至最少。本协议描述了使用热氟分析，结合自定义的24条件筛选，以确定缓冲条件，增加蛋白质热稳定性，使用保存的疱疹病毒蛋白UL37为例。详细说明了屏幕条件，运行Thermofluor的MATLAB脚本，并对数据进行了分析。与圆二色谱法（CD）相比，缓冲屏结合热荧光分析法为蛋白质热稳定性分析提供了一种快速、信息量大的方法。
[背景]蛋白UL37在疱疹病毒的生命周期中具有多种功能，是高效病毒复制所必需的。作为病毒膜的一个组成部分——夹在包含衣壳和脂质膜的基因组之间的一层——UL37不仅是病毒组装所必需的（Desai等人，2001年；Jambunathan等人，2014年），而且也是有效的衣壳运输（Leege等人，2009年）、神经入侵（Richards等人，2017年）和对抗宿主天然免疫应答（Liu等人，2008；Zhao等人，2016）。要更好地理解其多功能性的本质，就需要对其结构和生化特性有详细的了解，而这又需要性能良好的纯化蛋白质。
不同UL37结构体的初始制备在溶解度、单分散性和纯化蛋白的产率方面存在差异，使得蛋白制备不一致，进一步的表征也不可重现。由于缓冲优化是解决这些问题的直接方法，我们开发了一种24条件筛选法，可以改变缓冲剂、pH值以及NaCl和甘油的浓度，并将其与热氟分析法结合使用（Phillips等人，2011年），以确定最大限度提高热稳定性的缓冲条件。UL37的N端和C端具有可变的平均热稳定性和最佳缓冲条件（图1，表1）。然而，在所有情况下，提高蛋白质稳定性的条件也提高了蛋白质的溶解度，最终提高了纯化蛋白质的产量，从而促进了下游的生化特性。 ...
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| Quantification of Hydrogen Sulfide and Cysteine Excreted by Bacterial Cells
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Author:
Date:
2018-05-20
[Abstract] Bacteria release cysteine to moderate the size of their intracellular pools. They can also evolve hydrogen sulfide, either through dissimilatory reduction of oxidized forms of sulfur or through the deliberate or inadvertent degradation of intracellular cysteine. These processes can have important consequences upon microbial communities, because excreted cysteine autoxidizes to generate hydrogen peroxide, and hydrogen sulfide is a potentially toxic species that can block aerobic respiration by inhibiting cytochrome oxidases. Lead acetate strips can be used to obtain semiquantitative data of sulfide evolution (Oguri et al., 2012). Here we describe methods that allow more-quantitative and discriminatory measures of cysteine and hydrogen sulfide release from bacterial cells. An ...
[摘要] 细菌释放半胱氨酸以调节细胞内池的大小。它们也可以通过硫的氧化形式的异化还原或通过细胞内半胱氨酸的故意或无意降解来释放硫化氢。这些过程会对微生物群落产生重要影响，因为排泄的半胱氨酸会自动氧化生成过氧化氢，而硫化氢是一种潜在的毒性物种，可通过抑制细胞色素氧化酶来阻断有氧呼吸。醋酸铅条可用于获得硫化物演化的半定量数据（Oguri et al。，2012）。在这里，我们描述的方法，允许更多的定量和歧视措施半胱氨酸和硫化氢释放细菌细胞。提供了一个说明性实例，其中当暴露于外源性胱氨酸时，大肠杆菌迅速产生半胱氨酸和硫化物（Chonoles Imlay等人，2015; Korshunov等人， ，2016）。
【背景】微生物通过几种途径产生了减少的硫物质。硫酸盐还原菌利用还原过程作为能量生成的组成部分。其他细菌释放硫化物，作为硫物质（包括半胱氨酸）的蓄意或偶然降解的副产物。我们观察到半胱氨酸本身是在细胞内水平异常高时排泄的，这种情况可能通过不受控制的氨基酸输入或半胱氨酸合成失调发生。这些硫物质具有非同寻常的反应性，因为它们以高亲和力与金属结合，也是与分子氧发生化学反应的少数生物分子之一。结果是减少的硫化合物可以对细胞产生重要影响。因此，跟踪各种情况下含硫化合物的动态变化是非常重要的。
硫醇试剂 - 特别是5,5-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB） ...
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