| Preparation, FPLC Purification and LC-FT-ICR-MS of Proteins
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Author:
Date:
2020-04-05
[Abstract] High magnetic field Fourier transform ion cyclotron resonance (FT-ICR) mass spectrometers provide extremely high mass resolution (resolving power of ~200,000 at 400 m/z) protein detection across a broad mass range, enabling analysis of fine structure of isotopic peak clusters that is missed in other types of mass spectrometers. The protocol detailed here describes preparation of cellular extracts for purification of DNA-binding proteins using multiple chromatographic chemistries via fast protein liquid chromatography (FPLC), and identification and quantitation of the protein isoforms and their post-translational modifications by liquid chromatography coupled to Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (LC-FT-ICR-MS). This protocol benefits from selectively purifying ...
[摘要] [摘要] 高磁场傅里叶变换离子回旋共振（FT-ICR）质谱仪可在较宽的质量范围内提供极高的质量分辨率（在400 m / z处的分辨力约为200,000），可对同位素峰簇的精细结构进行分析在其他类型的质谱仪中被遗漏了。此处详细介绍的协议描述了使用多种色谱化学方法通过快速蛋白质液相色谱（FPLC）制备用于纯化DNA结合蛋白的细胞提取物的方法，以及通过液相色谱与傅立叶变换耦合对蛋白质同工型及其翻译后修饰的鉴定和定量离子回旋共振质谱（LC-FT-ICR-MS）。该协议受益于通过高分辨率FT-ICR选择性纯化蛋白质以进行鉴定和定量的方法，该技术具有确定性地区分乙酰化和三甲基化翻译后修饰（PTM）添加的能力。
[背景 ] 蛋白质翻译后修饰（翻译后修饰）的细胞过程和功能的调控中发挥非常重要的作用。由于大量潜在的修饰和可以修饰的氨基酸残基数量，PTM的表征具有挑战性。对于蛋白水解位点数量有限，无法以蛋白水解消化形式进行分析且需要完整的蛋白MS分析的蛋白质而言，尤其如此。为实现此目标，该方案描述了通过HPLC分离蛋白质和高精度/高分辨率质谱的方法。HPLC分离至：1 ）从目标蛋白质中消除各种盐和其他干扰分子，2 ）分离蛋白质的各种PTM亚型，3 ...
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| Heterologous Expression and Purification of the CRISPR-Cas12a/Cpf1 Protein
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Author:
Date:
2018-05-05
[Abstract] This protocol provides step by step instructions (Figure 1) for heterologous expression of Francisella novicida Cas12a (previously known as Cpf1) in Escherichia coli. It additionally includes a protocol for high-purity purification and briefly describes how activity assays can be performed. These protocols can also be used for purification of other Cas12a homologs and the purified proteins can be used for subsequent genome editing experiments.
Figure 1. Timeline of activities for the heterologous expression and purification of Francisella novicida Cas12a (FnCas12a) from Escherichia coli
[摘要] 该协议提供了分步说明（图1），用于在大肠杆菌中异源表达新西兰弗朗西斯菌弗朗西丝菌Cas12a（以前称为Cpf1）。 它还包括一个高纯度纯化方案，并简要介绍如何进行活性测定。 这些方案也可以用于其他Cas12a同系物的纯化，并且纯化的蛋白质可以用于随后的基因组编辑实验。
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图1.从大肠杆菌 异源表达和纯化<弗朗西斯弗朗西丝菌 Cas12a（FnCas12a）的活动时间表
【背景】原核CRISPR-Cas免疫系统通过使用CRISPR RNA（crRNA）作为外源DNA或RNA的序列特异性靶向的指导来提供针对病毒和质粒的保护（van der Oost等人，2014; Marraffini ，2015）。 1类CRISPR-Cas系统（包含I型，III型和IV型）通常形成多亚基蛋白-cRNA效应复合物，而2类系统（包含II型，V型和VI型）依赖于单个crRNA-引导的效应物核酸酶用于目标干扰（Mohanraju et al。 2016年）。
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