| Reconstitution of Chromatin by Stepwise Salt Dialysis
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Author:
Date:
2021-04-05
[Abstract] Chromatin, rather than plain DNA, is the natural substrate of the molecular machines that mediate DNA-directed processes in the nucleus. Chromatin can be reconstituted in vitro by using different methodologies. The salt dialysis method yields chromatin that consists of purified histones and DNA. This biochemically pure chromatin is well-suited for a wide range of applications. Here, we describe simple and straightforward protocols for the reconstitution of chromatin by stepwise salt dialysis and the analysis of the chromatin by the micrococcal nuclease (MNase) digestion assay. Chromatin that is reconstituted with this method can be used for efficient homology-directed repair (HDR)-mediated gene edited with the CRISPR-Cas9 system as well as for biochemical studies of chromatin dynamics and ...
[摘要] [摘要]染色质而不是普通的DNA是介导细胞核中DNA定向过程的分子机器的天然底物。染色质可以重新构建d体外b ÿ使用不同的方法。盐渗析法产生的染色质由纯化的组蛋白和DNA组成。这种生物化学纯的染色质非常适合广泛的应用。在这里，我们描述了通过逐步盐透析和通过微球菌核酸酶（MNase）消化测定法对染色质进行分析的染色质重构的简单明了的协议。该复原用该方法染色质，可用于高效同源定向修复（HDR）介导的基因编辑编 使用CRISPR-Cas9系统，以及用于染色质动力学和功能的生化研究。
[背景]真核细胞中的DNA被组织成染色质。因此，理想情况下，DNA定向过程的分析（例如复制，重组，修复和转录）将使用染色质模板而不是纯DNA进行（Kadonaga，2019）。为此，染色质可通过使用ATP依赖性或ATP依赖性方法在体外从纯化的成分中重建（有关综述，请参见Lusser和Kadonaga，2004年）。
在这里，我们描述了染色质重建的特定方法，该方法在我们利用CRISPR-Cas9系统对细胞进行HDR介导的基因编辑研究中采用了（Cruz-Becerra和Kadonaga，2020年）。在这项工作中，我们发现相对于普通的（裸）DNA供体模板，通过使用染色质供体模板可以增强精确的HDR介导的DNA插入。我们还将这种方法用于染色质的生化分析，包括高迁移性N组（HMGN）蛋白（Rattner等，2009），染色质动力学（Torigoe等，2013），前核小体（Fei）的表征。等人，2015年），以及核小体失稳因子（NDF）（F ...
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| Preserve Cultured Cell Cytonemes through a Modified Electron Microscopy Fixation
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Author:
Date:
2018-07-05
[Abstract] Immunocytochemistry of cultured cells is a common and effective technique for determining compositions and localizations of proteins within cellular structures. However, traditional cultured cell fixation and staining protocols are not effective in preserving cultured cell cytonemes, long specialized filopodia that are dedicated to morphogen transport. As a result, limited mechanistic interrogation has been performed to assess their regulation. We developed a fixation protocol for cultured cells that preserves cytonemes, which allows for immunofluorescent analysis of endogenous and over-expressed proteins localizing to the delicate cellular structures.
[摘要] 培养细胞的免疫细胞化学是用于确定细胞结构内蛋白质的组成和定位的常用且有效的技术。 然而，传统的培养细胞固定和染色方案不能有效地保存培养的细胞色素，长期专门用于形态发生转运的丝状伪足。 结果，进行了有限的机械审讯以评估其监管。 我们开发了一种用于培养细胞的固定方案，该方案保留了细胞质，允许对内源性和过表达的蛋白质进行免疫荧光分析，这些蛋白质定位于脆弱的细胞结构。
【背景】Cytonemes被分类为薄的（~200nm直径）基于肌动蛋白的丝状伪足，长度超过2μm，可以转运形态发生素（Ramírez-Weber和Kornberg，1999）。这些信号结构首先在发育中的 Drosophila 翼成像盘中进行了详细分类和描述，随后在小鼠，小鸡和斑马鱼模型生物中进行了观察（Ramírez-Weber和Kornberg，1999; Sanders et al。，2013; Stanganello et al。，2015）。在大多数情况下，只有对过表达的荧光标记蛋白进行实时成像才能进行细胞色素检测。由于传统的固定方案未能保存这些脆弱的细丝，因此对培养细胞的细胞色素的检查受到限制。这些并发症一直是决定在发育和组织稳态期间驱动细胞色素形成和功能的细胞机制以及确定这些过程是否在疾病中被破坏的限制因素。
为了克服这些限制，我们开发了一种基于修饰电子显微镜固定剂（MEM-fix）的方案，该方案可以保留培养细胞的细胞质。 ...
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| Host-regulated Hepatitis B Virus Capsid Assembly in a Mammalian Cell-free System
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Author:
Date:
2018-04-20
[Abstract] The hepatitis B virus (HBV) is an important global human pathogen and represents a major cause of hepatitis, liver cirrhosis and liver cancer. The HBV capsid is composed of multiple copies of a single viral protein, the capsid or core protein (HBc), plays multiple roles in the viral life cycle, and has emerged recently as a major target for developing antiviral therapies against HBV infection. Although several systems have been developed to study HBV capsid assembly, including heterologous overexpression systems like bacteria and insect cells, in vitro assembly using purified protein, and mammalian cell culture systems, the requirement for non-physiological concentrations of HBc and salts and the difficulty in manipulating host regulators of assembly presents major limitations ...
[摘要] 乙型肝炎病毒（HBV）是一种重要的全球人类病原体，并且是肝炎，肝硬化和肝癌的主要原因。 HBV衣壳由单个病毒蛋白的多个拷贝组成，衣壳或核心蛋白（HBc）在病毒生命周期中起着多重作用，并且最近已经成为开发抗HBV病毒疗法的主要靶标。尽管已经开发了几种用于研究HBV衣壳组装的系统，包括异源过表达系统如细菌和昆虫细胞，使用纯化蛋白质和哺乳动物细胞培养系统进行体外组装，但对非生理浓度HBc和盐以及难以操纵装配的宿主调节物在生理相关条件下的衣壳装配的详细研究方面存在主要限制。我们最近开发了基于兔网织红细胞裂解物（RRL）的哺乳动物无细胞系统，其中HBc以生理浓度表达并在近生理条件下组装成衣壳。该系统已经揭示了HBc装配要求，这是以前装配系统所不能预料的。此外，该系统中的衣壳组装受可容易操作的内源宿主因子调控。在这里，我们提供了这种无细胞衣壳装配系统的详细协议，包括如何操纵调节装配的宿主因子的说明。
【背景】乙型肝炎病毒（HBV）是一种重要的全球人类病原体，其长期感染全世界数以亿计的人并且代表病毒性肝炎，肝硬化和肝癌的主要原因（Seeger等人， 2013; Trepo et。，2014）。 HBV通过逆转录RNA中间体（所谓的前基因组RNA（pgRNA））在核衣壳内（NC）复制其基因组DNA（一种宽松的环状部分双链DNA（RC ...
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