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Date:
2018-04-20
[Abstract] This protocol describes the generation and functional validation of microRNA (miRNA) sponge or decoy constructs. When expressed from a strong promoter, these transcripts can sequester specific miRNA:RISC complexes, thereby resulting in a derepression of endogenous target mRNA. Hence, cells expressing such sponges display a partial or full miRNA loss-of-function phenotype.
Depending on the sponge sequence, the activity of any miRNA of choice can be inhibited by sponge sequestration, but it should be noted that these constructs do not seem to be specific for one particular miRNA. Rather, all miRNAs of the same family as defined by the seed sequence will be affected, albeit to a different degree.
[摘要] 该协议描述了microRNA（miRNA）海绵或诱饵构建体的产生和功能验证。 当从强启动子表达时，这些转录物可以隔离特定的miRNA：RISC复合物，从而导致内源性靶mRNA的去阻遏。 因此，表达这种海绵的细胞表现出部分或完全的miRNA功能丧失表型。
根据海绵序列的不同，所选择的miRNA的活性可以通过海绵螯合来抑制，但是应该指出，这些构建体对于一种特定的miRNA似乎并不是特异性的。 相反，由种子序列定义的同一家族的所有miRNA将受到影响，尽管程度不同。
【背景】微小RNA（miRNA）是短的非编码RNA，其大小约为21-24个核苷酸，其在转录后沉默哺乳动物中所有蛋白质编码基因的大部分。自从他们发现以来，越来越多的研究已经清楚地将这个监管层确定为几乎所有生理过程的关键要素。在这种情况下并不奇怪，miRNA的异常表达也与几种人类恶性肿瘤包括癌症有因果关系。
使用经典的功能增益方法，早期研究通常利用过表达来评估特定miRNA的功能。然而，与生理环境相比，这可以达到高达100倍或更高的miRNA水平，并且可能产生不一定与miRNA的正常功能相关的表型。
为了避免可能的过度表达伪影的这个显而易见的问题，在过去几年中已经开发了用于体内和体内使用的miRNA抑制的几种技术，从而允许分析一种特定的miRNA或一组miRNA以功能丧失的方式。这些包括例如miRNA诱饵或海绵的表达，通过以序列特异性方式隔离miRNA：RISC复合物来干扰miRNA功能的长转录物（Ebert等人。 ...
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