| FRET Reporter Assays for cAMP and Calcium in a 96-well Format Using Genetically Encoded Biosensors Expressed in Living Cells
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Author:
Date:
2020-06-05
[Abstract] Stimulation of G protein-coupled receptors (GPCR) by hormones and neurotransmitters elicits cellular responses, many of which result from alterations in the concentrations of cytosolic cAMP and Ca2+. Here, we describe a microplate reader fluorescence resonance energy transfer (FRET) assay that uses the genetically encoded biosensors H188 and YC3.60 so that it is possible to monitor the kinetics with which alterations of [cAMP] or [Ca2+] occur in monolayers or suspensions of living cells exposed to GPCR agonists. This protocol uses HEK293 cell lines doubly transfected with a FRET biosensor and a recombinant GPCR of interest (e.g., glucagon receptors, CCK2 receptors, or NPY2R receptors). The protocol allows for rapid screening of small molecule GPCR ...
[摘要] [摘要] 激素和神经递质刺激G蛋白偶联受体（GPCR）引起细胞反应，其中许多是由于胞质cAMP和Ca 2+ 浓度的变化所致。在这里，我们描述了酶标仪的荧光共振能量转移使用遗传编码的生物传感器H188和YC3.60进行FRET）分析，从而可以监测暴露于GPCR激动剂的活细胞的单层或悬浮液中[cAMP]或[Ca 2+ ]发生变化的动力学。该协议使用FRET 生物传感器和感兴趣的重组GPCR 双重转染的HEK293细胞系（例如 ，胰高血糖素受体，CCK 2 受体或NPY2R受体）。该方案可快速筛选小分子GPCR 激动剂和拮抗剂，它还可用于发现具有GPCR活化作用的合成单，双和三激动肽。属性。
[背景] 活细胞荧光共振能量转移（FRET）分析结合显微镜和数字成像技术通常用于监测cAMP和Ca 2+的水平响应GPCR激动剂刺激而波动的动力学。另一种不使用显微镜的方法，而是使用自动荧光分光光度计和活细胞的单层或悬浮液，以96孔格式基于FRET的cAMP和Ca 2+ 的检测。该方案使用基因编码的生物传感器，以实现平均动力学可以在已知浓度应用GPCR激动剂的条件下，使用酶标仪实时获得药理研究数据。这些FRET分析使用稳定表达cAMP生物传感器H188（Klarenbeek 等人，2015 ）或Ca的细胞系2+ 生物传感器YC3.60（Nagai ...
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| Guanine Nucleotide Exchange Assay Using Fluorescent MANT-GDP
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] GTPases are molecular switches that cycle between the inactive GDP-bound state and the active GTP-bound state. GTPases exchange nucleotides either by its intrinsic nucleotide exchange or by interaction with guanine nucleotide exchange factors (GEFs). Monitoring the nucleotide exchange in vitro, together with reconstitution of direct interactions with regulatory proteins, provides key insights into how a GTPase is activated. In this protocol, we describe core methods to monitor nucleotide exchange using fluorescent N-Methylanthraniloyl (MANT)-guanine nucleotide.
[摘要] GTP酶是分子开关，在无效GDP结合状态和活性GTP结合状态之间循环。 GTP酶通过其内在的核苷酸交换或通过与鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）的相互作用来交换核苷酸。 监测体外核苷酸交换，以及与调节蛋白直接相互作用的重构，为GTP酶如何被激活提供了重要见解。 在该协议中，我们描述了使用荧光N-甲基呋喃酰基（MANT） - 鸟嘌呤核苷酸来监测核苷酸交换的核心方法。
【背景】GTPase是鸟嘌呤核苷酸结合蛋白，调节细胞过程的广度，从蛋白质生物合成到细胞周期进展，从细胞骨架重组到膜运输。 GTPases可以被认为是分子开关，它在GDP结合“关闭”状态和GTP结合“开启”状态之间循环;在通过GTP的GDP核苷酸交换结合GTP时，GTP酶变得活跃并且将结合下游效应蛋白以招募和激活这些效应子的生物学功能。 GTP酶通过与开关I环（G2结构域）的高度保守苏氨酸和开关II环（G3结构域）的DxxG基序内的甘氨酸的相互作用结合GTP的γ-磷酸。 GTP水解后，与γ-磷酸相互作用的丧失导致动态构象变化，从而使GTPase变为关闭状态（Vetter and ...
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| Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] Oxidative stress is implicated in the pathogenesis of various neurodegenerative diseases, including Alzheimer’s disease. Oxidative stress is a result of a disruption of the equilibrium between antioxidants and oxidants, in favor of oxidants. Since mitochondria are major sites of production and reduction of reactive oxygen species (ROS), measurement of ROS levels can help us determine if mitochondrial functional integrity has been compromised. In this protocol, we describe a method to measure the level of ROS in the nematode Caenorhabditis elegans, using chloromethyl-2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate (CM-H2DCFDA).
[摘要] 氧化应激涉及各种神经退行性疾病的发病机制，包括阿尔茨海默病。 氧化应激是抗氧化剂和氧化剂之间平衡中断的结果，有利于氧化剂。 由于线粒体是主要的产生和活性氧（ROS）减少的部位，ROS水平的测量可帮助我们确定线粒体功能完整性是否受到损害。 在该协议中，我们描述了使用氯甲基-2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（CM-H 2），测量线虫秀丽隐杆线虫中ROS的水平的方法，DCFDA）。
【背景】ROS的生命周期与线粒体密切相关。超氧化物是由于线粒体中电子传递链的复合物I和复合物III不可避免地发生电子泄漏而产生的。这种超氧化物然后在线粒体基质和线粒体膜间隙中被过氧化氢歧化。通过这些过程产生的超氧化物和过氧化氢被认为是ROS，其中线粒体负责90％的内源性ROS（Balaban等人，2005）。因此，测量ROS水平将提供对线粒体健康状况的了解。在这里，我们提供了一个协议来确定线虫中的ROS水平。使用CM-H 2 DCFDA（一种还原形式的荧光素的渗透细胞氯甲基衍生物）的线虫。一旦进入细胞内，CM-H 2 DCFDA被细胞内酯酶切割，并且由ROS产生的氧化产生的非荧光H 2 DCF被转化为高度荧光的2 '，7'-二氯荧光素（DCF）。活体C中H 2 DCFDA的荧光强度的成像和测量。 elegans ...
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