| Isolation of Nuclei in Tagged Cell Types (INTACT), RNA Extraction and Ribosomal RNA Degradation to Prepare Material for RNA-Seq
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] Gene expression is dynamically regulated on many levels, including chromatin accessibility and transcription. In order to study these nuclear regulatory events, we describe our method to purify nuclei with Isolation of Nuclei in TAgged Cell Types (INTACT). As nuclear RNA is low in polyadenylated transcripts and conventional pulldown methods would not capture non-polyadenylated pre-mRNA, we also present our method to remove ribosomal RNA from the total nuclear RNA in preparation for nuclear RNA-Seq.
[摘要] 基因表达在多个水平上动态调节，包括染色质可及性和转录。 为了研究这些核调节事件，我们描述了我们用净化细胞核（INTACT）纯化细胞核的方法。 由于核RNA在聚腺苷酸化转录物中低并且常规下拉方法不会捕获非聚腺苷酸化前mRNA，所以我们还提出了我们的方法以从核RNA总RNA中去除核糖体RNA以准备核RNA-Seq。
【背景】分离用于基因表达实验的特定细胞类型降低了噪音并提高了实验的精确度和发现的不同表达基因的数量。用于细胞类型特异性研究的各种方法被广泛使用，每种方法都有其优点和缺点（Bailey-Serres，2013年综述）。分离特定的调控区室，如细胞核（来自细胞器，核糖体，细胞质，等等）可以进一步精确解析调控基因表达的分子事件。在这里，我们描述了一种方法，可以从冷冻组织中分离特定细胞类型的细胞核，适用于研究核基因表达的实验（例如，核RNA的RNA-Seq，ATAC-Seq，ChIP -Seq，等。）。此外，我们描述了RNA的处理，导致材料适合作为RNA-Seq实验的输入。这里描述的方案与水稻根组织（日本野生稻栽培品种日本晴）（Reynoso等人，2018年）一起使用，但是它们基于以前开发的方案， （拟订和Henikoff，2010年和2011年）和番茄（罗恩等人，2014年）。
该协议的第一部分，INTACT方法（用于标记特定细胞类型的核的分离）允许体内亲和标记和随后从感兴趣的细胞类型中纯化细胞核。这是通过由包膜靶向结构域，GFP和生物素连接酶识别肽（BLRP）组成的三联核标签融合蛋白（NTF）的细胞类型特异性表达实现的。 ...
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| Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] Oxidative stress is implicated in the pathogenesis of various neurodegenerative diseases, including Alzheimer’s disease. Oxidative stress is a result of a disruption of the equilibrium between antioxidants and oxidants, in favor of oxidants. Since mitochondria are major sites of production and reduction of reactive oxygen species (ROS), measurement of ROS levels can help us determine if mitochondrial functional integrity has been compromised. In this protocol, we describe a method to measure the level of ROS in the nematode Caenorhabditis elegans, using chloromethyl-2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate (CM-H2DCFDA).
[摘要] 氧化应激涉及各种神经退行性疾病的发病机制，包括阿尔茨海默病。 氧化应激是抗氧化剂和氧化剂之间平衡中断的结果，有利于氧化剂。 由于线粒体是主要的产生和活性氧（ROS）减少的部位，ROS水平的测量可帮助我们确定线粒体功能完整性是否受到损害。 在该协议中，我们描述了使用氯甲基-2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（CM-H 2），测量线虫秀丽隐杆线虫中ROS的水平的方法，DCFDA）。
【背景】ROS的生命周期与线粒体密切相关。超氧化物是由于线粒体中电子传递链的复合物I和复合物III不可避免地发生电子泄漏而产生的。这种超氧化物然后在线粒体基质和线粒体膜间隙中被过氧化氢歧化。通过这些过程产生的超氧化物和过氧化氢被认为是ROS，其中线粒体负责90％的内源性ROS（Balaban等人，2005）。因此，测量ROS水平将提供对线粒体健康状况的了解。在这里，我们提供了一个协议来确定线虫中的ROS水平。使用CM-H 2 DCFDA（一种还原形式的荧光素的渗透细胞氯甲基衍生物）的线虫。一旦进入细胞内，CM-H 2 DCFDA被细胞内酯酶切割，并且由ROS产生的氧化产生的非荧光H 2 DCF被转化为高度荧光的2 '，7'-二氯荧光素（DCF）。活体C中H 2 DCFDA的荧光强度的成像和测量。 elegans ...
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