A Quantitative Single-cell Flow Cytometry Assay for Retrograde Membrane Trafficking Using Engineered Cholera Toxin
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Author:
Date:
2020-08-05
[Abstract] The organization and distribution of proteins, lipids, and nucleic acids in eukaryotic cells is an essential process for cell function. Retrograde trafficking from the plasma membrane to the Golgi and endoplasmic reticulum can greatly modify cell membrane composition and intracellular protein dynamics, and thus typifies a key sorting step. However, methods to efficiently quantify the extent or kinetics of these events are currently limited. Here, we describe a novel quantitative and effectively real-time single-cell flow cytometry assay to directly measure retrograde membrane transport. The assay takes advantage of the well-known retrograde trafficking of cholera toxin engineered with split-fluorescent proteins to generate novel tools for immediate monitoring of intracellular trafficking. ...
[摘要] [摘要]蛋白质、脂类和核酸在真核细胞中的组织和分布是细胞功能的重要过程。从质膜到高尔基体和内质网的逆向运输可以极大地改变细胞膜的组成和细胞内蛋白质的动态变化,因此是一个关键的分选步骤。然而,有效量化这些事件的程度或动力学的方法目前是有限的。在这里,我们描述了一种新的定量和有效的实时单细胞流式细胞术检测直接测量逆行膜转运。这项检测利用了众所周知的霍乱毒素逆行转移的特性,利用裂解荧光蛋白产生了新的工具,用于即时监测细胞内的转移。这种方法将大大扩展研究细胞内膜转运的生物学基础,以及细胞膜转运系统如何适应不同细胞类型和细胞状态的生理需要。
[背景]所有的真核细胞都依赖于它们动态地将分子分类和分离到膜结合的亚细胞器中的能力,以便组织和分配到细胞的特定区域。在这一过程中的一个重要步骤是早期分类内体和跨高尔基网络(TGN)。在从分选内体产生的其他贩运途径中,通过分泌途径到TGN的逆行贩运是一个关键的分选步骤(Johannes和Popoff,2008)。细胞膜蛋白和脂类发生逆向转运。从TGN到内质网(ER)的进一步逆行贩运可通过一些质膜脂质完成,并可巧妙地由几种细菌毒素和病毒协同作用而致病(Cho等人,2012年;Personnic等人,2016年;Williams和Tsai,2016年)。
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Guanine Nucleotide Exchange Assay Using Fluorescent MANT-GDP
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] GTPases are molecular switches that cycle between the inactive GDP-bound state and the active GTP-bound state. GTPases exchange nucleotides either by its intrinsic nucleotide exchange or by interaction with guanine nucleotide exchange factors (GEFs). Monitoring the nucleotide exchange in vitro, together with reconstitution of direct interactions with regulatory proteins, provides key insights into how a GTPase is activated. In this protocol, we describe core methods to monitor nucleotide exchange using fluorescent N-Methylanthraniloyl (MANT)-guanine nucleotide.
[摘要] GTP酶是分子开关,在无效GDP结合状态和活性GTP结合状态之间循环。 GTP酶通过其内在的核苷酸交换或通过与鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)的相互作用来交换核苷酸。 监测体外核苷酸交换,以及与调节蛋白直接相互作用的重构,为GTP酶如何被激活提供了重要见解。 在该协议中,我们描述了使用荧光N-甲基呋喃酰基(MANT) - 鸟嘌呤核苷酸来监测核苷酸交换的核心方法。
【背景】GTPase是鸟嘌呤核苷酸结合蛋白,调节细胞过程的广度,从蛋白质生物合成到细胞周期进展,从细胞骨架重组到膜运输。 GTPases可以被认为是分子开关,它在GDP结合“关闭”状态和GTP结合“开启”状态之间循环;在通过GTP的GDP核苷酸交换结合GTP时,GTP酶变得活跃并且将结合下游效应蛋白以招募和激活这些效应子的生物学功能。 GTP酶通过与开关I环(G2结构域)的高度保守苏氨酸和开关II环(G3结构域)的DxxG基序内的甘氨酸的相互作用结合GTP的γ-磷酸。 GTP水解后,与γ-磷酸相互作用的丧失导致动态构象变化,从而使GTPase变为关闭状态(Vetter and ...
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