| Time-of-addition and Temperature-shift Assays to Determine Particular Step(s) in the Viral Life Cycle that is Blocked by Antiviral Substance(s)
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Author:
Date:
2018-05-05
[Abstract] Viruses infect their host cells to produce progeny virus particles through the sequential steps of the viral life cycle, such as viral attachment, entry, penetration and post-entry events. This protocol describes time-of-addition and temperature-shift assays that are employed to explore which step(s) in the viral life cycle is blocked by an antiviral substance(s).
[摘要] 病毒通过病毒生命周期的连续步骤感染它们的宿主细胞以产生子代病毒颗粒，例如病毒附着，进入，穿透和进入后事件。 该协议描述了用于探索病毒生命周期中的哪个或哪些步骤被抗病毒物质阻断的添加时间（time-of-addition）和温度变化分析。
【背景】病毒是专门的细胞内寄生虫，它们劫持宿主细胞机制来复制它们自己的基因组。病毒的生命周期通过感染性病毒颗粒（病毒粒子）附着（结合）到宿主细胞表面并将其穿透（内化，融合）到细胞内区室中进行，其中病毒粒子脱壳（分解）发生，然后是病毒基因组转录/复制，病毒蛋白质合成和病毒体组装，最终导致感染细胞产生和释放子代病毒体（Scheel and Rice，2013）。
为了探索病毒生命周期的哪个或哪些步骤被抗病毒物质阻断，进行药物添加时间实验。简而言之，在病毒接种细胞的不同时间点将病毒和/或宿主细胞添加到病毒和/或宿主细胞中（Chen等人，2017）：（1）预处理在病毒接种前带有抗病毒物质的细胞检查该物质是否可以阻断病毒受体以抑制病毒与宿主细胞的附着或者是否可以诱导产生抗病毒宿主因子如干扰素。 （2）对病毒进行预处理，然后将处理过的病毒接种到细胞中，检查抗病毒物质的杀病毒活性或中和活性。 （3）病毒接种期间细胞和病毒的共同处理检查病毒进入步骤的抗病毒效果，包括杀病毒（中和）活性和阻断病毒附着和细胞渗透。 ...
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| CRISPR-mediated Tagging with BirA Allows Proximity Labeling in Toxoplasma gondii
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] Defining protein interaction networks can provide key insights into how protein complexes govern complex biological problems. Here we define a method for proximity based labeling using permissive biotin ligase to define protein networks in the intracellular parasite Toxoplasma gondii. When combined with CRISPR/Cas9 based tagging, this method provides a robust approach to defining protein networks. This approach detects interaction within intact cells, it is applicable to both soluble and insoluble components, including large proteins complexes that interact with the cytoskeleton and unique microtubule organizing center that comprises the apical complex in apicomplexan parasites.
[摘要] 定义蛋白质相互作用网络可以为蛋白质复合物如何控制复杂的生物学问题提供关键信息 在这里我们定义了一种基于接近度的标记方法，使用宽容的生物素连接酶来定义细胞内寄生虫弓形虫的蛋白质网络。 当与基于CRISPR / Cas9的标记结合使用时，这种方法提供了一种可靠的方法来定义蛋白质网络。 这种方法检测完整细胞内的相互作用，它适用于可溶性和不可溶性成分，包括与细胞骨架相互作用的大型蛋白质复合物和独特的微管组织中心，其中包括顶尖复合体在顶尖复合寄生虫中。
【背景】分析蛋白质 - 蛋白质相互作用是解决蛋白质如何组装和作为大分子复合物的关键努力。传统上，通过免疫共沉淀（共-IP）和随后的质谱分析已经鉴定出蛋白质复合物。然而，一些蛋白质复合物取代基可能在co-IP的裂解，下拉和洗涤步骤期间人为失去或获得，这对于不溶性膜或需要侵蚀性溶解的结构蛋白质尤其成问题。作为co-IP的替代物，邻近依赖性生物素鉴定（BioID）提供了在正常细胞稳态期间紧邻目标靶蛋白的蛋白质“快照”（Roux等人，2012年）。 BioID利用融合到感兴趣的靶蛋白的混杂的大肠杆菌生物素蛋白连接酶（BirA）。生物素补充使得BirA融合物在30纳米内允许生物素化的近邻生物体（Roux et al。，2012; Van Itallie et al。，2013） ...
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