| Application of Mechanical Forces on Drosophila Embryos by Manipulation of Microinjected Magnetic Particles
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Author:
Date:
2020-05-05
[Abstract] Cells generate mechanical forces to shape tissues during morphogenesis. These forces can activate several biochemical pathways and trigger diverse cellular responses by mechano-sensation, such as differentiation, division, migration and apoptosis. Assessing the mechano-responses of cells in living organisms requires tools to apply controlled local forces within biological tissues. For this, we have set up a method to generate controlled forces on a magnetic particle embedded within a chosen tissue of Drosophila embryos. We designed a protocol to inject an individual particle in early embryos and to position it, using a permanent magnet, within the tissue of our choice. Controlled forces in the range of pico to nanonewtons can be applied on the particle with the use of an ...
[摘要] [ 摘要] 电池产生的机械力塑造组织形态发生过程。这些力量可以激活一些生化途径和触发多元化Ç Ellular回应机械性-感，如分化，分裂，迁移和凋亡。评估的机械性-响应细胞在活生物体需要在生物组织内施加受控局部力的工具，为此，我们建立了一种方法来对嵌入果蝇胚胎所选组织内的磁性粒子产生受控力，并设计了将单个粒子注入早期胚胎的方案。并使用永久磁铁将其定位在我们选择的组织内。可以使用事先已校准的电磁体，将微微至纳牛顿范围内的控制力施加到微粒上。施加力后上皮变形可通过实时成像进行跟踪，并使用简单分析进行进一步分析 该工具已成功用于识别胃胚形成之前胚盘中的力学变化。该协议提供了以下细节：（i）在果蝇胚胎中注入磁性粒子，（ii）校准电磁体，以及（iii）在活体组织中施加控制力。
[ 背景] 果蝇胚胎发育是一个经典模型对于形态（坎波斯，奥尔特加和哈滕斯坦，1985年）。尽管许多工具已经开发评估具体蛋白质形态的作用，评估细胞部队或力学仍然具有挑战性。在过去的十五年来，激光解剖是评估细胞力最常用的方法（Colombelli和Solon，2013； Shivakumar和Lenne，2016）。然而，激光解剖是侵入性的，会伤及组织，不利于异位力的施加。。为了克服这些限制，一些方法已经发展到探头的磁流体或通过光阱蜂窝结组织通过诱导变形以液滴的力学（Bambardekar ...
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| Extraction and Quantification of Polyphosphate (polyP) from Gram-negative Bacteria
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Author:
Date:
2018-09-20
[Abstract] Polyphosphate (polyP), a universally conserved biomolecule, is composed of up to 1,000 phosphate monomers linked via phosphoanhydride bonds. Reaching levels in bacteria that are in the high nmoles per mg protein range, polyP plays important roles in biofilm formation and colonization, general stress protection and virulence. Various protocols for the detection of polyP in bacteria have been reported. These methods primarily differ in the ways that polyP is extracted and/or detected. Here, we report an improved method, in which we combine polyP extraction via binding to glassmilk with a very sensitive PolyP kinase/luciferase-based detection system. By using this procedure, we significantly enhanced the sensitivity of polyP detection, making it potentially applicable for mammalian tissues.
[摘要] 多磷酸盐（polyP）是一种普遍保守的生物分子，由多达1,000个通过磷酸酐键连接的磷酸盐单体组成。 达到每毫克蛋白质高纳摩尔细菌的水平，polyP在生物膜形成和定植，一般应力保护和毒力中起重要作用。 已经报道了用于检测细菌中polyP的各种方案。 这些方法主要在于提取和/或检测polyP的方式不同。 在这里，我们报告了一种改进的方法，其中我们结合polyP提取通过结合到玻璃奶与非常敏感的PolyP激酶/荧光素酶检测系统。 通过使用该程序，我们显着增强了polyP检测的灵敏度，使其可能适用于哺乳动物组织。
【背景】聚磷酸盐（polyP）是一种由多达1,000种无机磷酸盐单体的直链组成的生物聚合物，存在于生命的所有三个领域的细胞中。然而，细菌是唯一已经充分研究了polyP代谢酶的生物。将ATP转化为polyP的细菌polyP激酶（PPK）催化正向和反向反应。虽然polyP的合成显然是细胞中有利的反应，但通过在体外提供足够量的ADP ，该酶可用于从polyP产生ATP，使得基于荧光素酶的ATP检测成为可能（Ault -Riché et al。，1998）。缺乏PPK的细菌在生物膜形成，运动性，持久性和各种应激反应方面存在缺陷，并显示出对次卤酸（即，漂白）应激或磷酸盐饥饿的显着增加的敏感性（图1）（Rao et al。，2009; Gray et ...
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| In vivo Analysis of Cyclic di-GMP Cyclase and Phosphodiesterase Activity in Escherichia coli Using a Vc2 Riboswitch-based Assay
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Author:
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2018-03-05
[Abstract] Cyclic di-guanosine monophosphate (c-di-GMP) is a ubiquitous second messenger that regulates distinct aspects of bacterial physiology. It is synthesized by diguanylate cyclases (DGCs) and hydrolyzed by phosphodiesterases (PDEs). To date, the activities of DGC and PDE are commonly assessed by phenotypic assays, mass spectrometry analysis of intracellular c-di-GMP concentration, or riboswitch-based fluorescent biosensors. However, some of these methods require cutting-edge equipment, which might not be available in every laboratory. Here, we report a new simple, convenient and cost-effective system to assess the function of DGCs and PDEs in E. coli. This system utilizes the high specificity of a riboswitch to c-di-GMP and its ability to regulate the expression of a downstream ...
[摘要] 环状二磷酸鸟苷（c-di-GMP）是一种无处不在的第二信使，它调节细菌生理学的不同方面。 它由diguanylate环化酶（DGC）合成并被磷酸二酯酶（PDE）水解。 迄今为止，通常通过表型分析，细胞内c-di-GMP浓度的质谱分析或基于核糖开关的荧光生物传感器来评估DGC和PDE的活性。 但是，其中一些方法需要尖端设备，而这些设备可能不适用于每个实验室。 在这里，我们报告了一个新的简单，方便和具有成本效益的系统，用于评估E中DGC和PDE的功能。大肠杆菌。 该系统利用核糖开关对c-di-GMP的高特异性及其响应于c-di-GMP浓度而调节下游β-半乳糖苷酶报道基因的表达的能力。 在该协议中，我们描述了该系统的构建及其用于评估DGC和PDE酶的活性。
【背景】Cyclic-di-GMP是细菌中重要且无处不在的第二信使，其调节各种过程，例如运动到衰退转变，生物膜形成，毒力和细胞周期进展（Römling等人， ，2013）。 GG（D / ...
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