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Date:
2018-02-20
[Abstract] Next generation high-throughput sequencing has enabled sensitive and unambiguous analysis of RNA populations in cells. Here, we describe a method for isolation and strand-specific sequencing of small RNA pools from bacteria that can be multiplexed to accommodate multiple biological samples in a single experiment. Small RNAs are isolated by polyacrylamide gel electrophoresis and treated with T4 polynucleotide kinase. This allows for 3’ adapter ligation to CRISPR RNAs, which don’t have pre-existing 3’-OH ends. Pre-adenylated adapters are then ligated using T4 RNA ligase 1 in the absence of ATP and with a high concentration of polyethylene glycol (PEG). The 3’ capture step enables precise determination of the 3’ ends of diverse RNA molecules. Additionally, a random hexamer in the ligated ...
[摘要] 新一代高通量测序技术能够对细胞中的RNA群体进行敏感和明确的分析。在这里，我们描述了一种从细菌中分离和链特异性测序小RNA池的方法，所述细菌可以在单个实验中多路复用以容纳多个生物样品。小RNA通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并用T4多核苷酸激酶处理。这允许3'衔接头连接至CRISPR RNA，其不具有预先存在的3'-OH末端。然后使用T4 RNA连接酶1在不存在ATP和高浓度聚乙二醇（PEG）的情况下将前腺苷酸化的衔接子连接。 3'捕获步骤能够精确测定不同RNA分子的3'末端。此外，连接适配器中的随机六聚体有助于控制潜在的下游扩增偏差。逆转录后，将cDNA产物环化并通过PCR制备文库。我们显示扩增的文库不需要通过凝胶电泳可见，以期望产物的有效测序。使用这种方法，我们通常从少量纯化的小RNA制备RNA测序文库。该协议适合于通过对成熟的CRISPR RNA进行测序来测定细菌中的CRISPR RNA生物合成，但可以用于测序不同类型的小RNA。我们还提供了一个完整的数据处理管道示例，并提供了运行所提供脚本的说明。
【背景】与聚集的经常散布的短回文重复序列（CRISPR）相关的遗传模块赋予不同的原核宿主适应性免疫（Barrangou et ...
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