| A Quantitative Single-cell Flow Cytometry Assay for Retrograde Membrane Trafficking Using Engineered Cholera Toxin
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Author:
Date:
2020-08-05
[Abstract] The organization and distribution of proteins, lipids, and nucleic acids in eukaryotic cells is an essential process for cell function. Retrograde trafficking from the plasma membrane to the Golgi and endoplasmic reticulum can greatly modify cell membrane composition and intracellular protein dynamics, and thus typifies a key sorting step. However, methods to efficiently quantify the extent or kinetics of these events are currently limited. Here, we describe a novel quantitative and effectively real-time single-cell flow cytometry assay to directly measure retrograde membrane transport. The assay takes advantage of the well-known retrograde trafficking of cholera toxin engineered with split-fluorescent proteins to generate novel tools for immediate monitoring of intracellular trafficking. ...
[摘要] [摘要]蛋白质、脂类和核酸在真核细胞中的组织和分布是细胞功能的重要过程。从质膜到高尔基体和内质网的逆向运输可以极大地改变细胞膜的组成和细胞内蛋白质的动态变化，因此是一个关键的分选步骤。然而，有效量化这些事件的程度或动力学的方法目前是有限的。在这里，我们描述了一种新的定量和有效的实时单细胞流式细胞术检测直接测量逆行膜转运。这项检测利用了众所周知的霍乱毒素逆行转移的特性，利用裂解荧光蛋白产生了新的工具，用于即时监测细胞内的转移。这种方法将大大扩展研究细胞内膜转运的生物学基础，以及细胞膜转运系统如何适应不同细胞类型和细胞状态的生理需要。
[背景]所有的真核细胞都依赖于它们动态地将分子分类和分离到膜结合的亚细胞器中的能力，以便组织和分配到细胞的特定区域。在这一过程中的一个重要步骤是早期分类内体和跨高尔基网络（TGN）。在从分选内体产生的其他贩运途径中，通过分泌途径到TGN的逆行贩运是一个关键的分选步骤（Johannes和Popoff，2008）。细胞膜蛋白和脂类发生逆向转运。从TGN到内质网（ER）的进一步逆行贩运可通过一些质膜脂质完成，并可巧妙地由几种细菌毒素和病毒协同作用而致病（Cho等人，2012年；Personnic等人，2016年；Williams和Tsai，2016年）。
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| An Improved Method for Measuring Chromatin-binding Dynamics Using Time-dependent Formaldehyde Crosslinking
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Author:
Date:
2018-02-20
[Abstract] Formaldehyde crosslinking is widely used in combination with chromatin immunoprecipitation (ChIP) to measure the locations along DNA and relative levels of transcription factor (TF)-DNA interactions in vivo. However, the measurements that are typically made do not provide unambiguous information about the dynamic properties of these interactions. We have developed a method to estimate binding kinetic parameters from time-dependent formaldehyde crosslinking data, called crosslinking kinetics (CLK) analysis. Cultures of yeast cells are crosslinked with formaldehyde for various periods of time, yielding the relative ChIP signal at particular loci. We fit the data using the mass-action CLK model to extract kinetic parameters of the TF-chromatin interaction, including the on- and ...
[摘要] 甲醛交联广泛用于与染色质免疫沉淀（ChIP）相结合来测量沿着DNA的相对位置以及转录因子（TF）-DNA相互作用的体内相对水平。但是，通常所做的测量不能提供关于这些交互的动态属性的明确信息。我们已经开发了一种方法来评估来自时间依赖性甲醛交联数据的结合动力学参数，称为交联动力学（CLK）分析。酵母细胞的培养物与甲醛交联不同的时间段，在特定位点产生相对的ChIP信号。我们使用质量作用CLK模型来拟合数据，以提取TF-染色质相互作用的动力学参数，包括开关速率和交联速率。从停车费和停车费中我们可以获得停车和停车时间。以下方案是该方法的第二次迭代，CLKv2，更新了改进的交联和淬火条件，更多关于交联速率的信息以及对观察到的动力学模型建模的系统程序。已应用CLKv2分析来研究TATA结合蛋白（TBP）和其他TF的选定子集的结合行为。该协议使用酵母细胞开发，但也可适用于来自其他生物体的细胞。
【背景】转录起始是一个复杂的过程，涉及染色质化启动子上数十种蛋白的协作和协调相互作用（Kim等人，2005; Encode Consortium，2012; Rhee等人， ，2012; Dowen等人，2014年）。许多研究已经研究了体外核心转录机器的组装和调控（Zawel和Reinberg，1992; Conaway和Conaway，1993; Roeder，1996; ...
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