| Hyaluronan Isolation from Mouse Mammary Gland
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Author:
Date:
2018-06-05
[Abstract] The glycosaminoglycan hyaluronan (HA) is a key component of the extracellular matrix. The molecular weight of HA is heterogeneous and can reach from several million to several hundred daltons. The effect of HA on cell behavior is size dependent; fragmented HA acts as a danger signal, stimulates cell migration and proliferation and is proinflammatory, native high molecular weight HA suppresses inflammation. Therefore, it is important to analyze HA size distribution when studying the role of HA in tissue homeostasis and pathology. This protocol describes isolation of HA from mouse mammary glands but can also be applied to other tissues. The quality of the isolated HA is sufficient to analyze size distribution by gel electrophoresis (Calabro et al., 2000).
[摘要] 糖胺聚糖透明质酸（HA）是细胞外基质的关键组分。 HA的分子量是不均匀的，可以达到几百万至几百道尔顿。 HA对细胞行为的影响与尺寸有关; 片段化的HA作为危险信号起作用，刺激细胞迁移和增殖并且是促炎性的，原生高分子量HA抑制炎症。 因此，在研究HA在组织稳态和病理学中的作用时，分析HA的大小分布非常重要。 该协议描述从小鼠乳腺分离HA，但也可以应用于其他组织。 分离的HA的质量足以通过凝胶电泳分析大小分布（Calabro等人，2000）。
【背景】糖胺聚糖HA由N-乙酰葡糖胺和β葡萄糖醛酸二糖组成，并且是细胞外基质的普遍存在的组分。 高分子量HA通过酶促降解和被活性氧和氮物质氧化而碎裂。 在健康组织中，大部分HA具有高分子量。 片段化HA的积累在病理过程中起着危险信号的作用（Tolg等人，2012和2017; Yuan等人，2015）。 例如，HA片段刺激炎症，而高分子量HA抑制炎症。 HA通过与细胞膜受体相互作用影响细胞行为，如细胞迁移和增殖，导致信号通路的激活。 由于受体-HA相互作用受HA大小的影响，HA对组织生物学的影响不仅取决于HA量，而且取决于各个细胞的HA大小分布和HA受体表达。
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| Purification of Total RNA from DSS-treated Murine Tissue via Lithium Chloride Precipitation
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Author:
Date:
2018-05-05
[Abstract] We have developed a protocol to purify RNA from DSS (Dextran Sulfate Sodium)-treated mouse tissues. This method, which prevents downstream inhibition of q-RT-PCR observed in DSS-treated tissues, relies on successive precipitations with lithium chloride.
[摘要] 我们开发了一种从DSS（葡聚糖硫酸钠）处理的小鼠组织中纯化RNA的方案。 这种防止DSS处理组织中观察到的q-RT-PCR下游抑制的方法依赖于氯化锂的连续沉淀。
【背景】葡聚糖硫酸钠（DSS）在实验室中非常普遍地用于诱导啮齿动物的结肠炎。具体而言，它模拟人类炎性肠病（IBD）与溃疡性结肠炎（UC）特征的临床和组织学特征。 DSS在饮用水中稀释并穿透组织。我们已经观察到用DSS污染RNA提取物阻止了从结肠和小肠成功的后续扩增过程，但也阻止了从DSS处理的动物获得的血液和其他组织。之前我们已经证明，样品中DSS的存在抑制了逆转录和聚合酶链式反应扩增（Viennois等人，2013）。 Kerr等人以剂量依赖的方式观察到这种抑制作用，他们提出了基于多聚-A纯化的技术以从总RNA提取物中去除DSS（Kerr等人，，2012）。我们在此提出了另一种有效和经济的方法，用于基于氯化锂（LiCl）沉淀纯化来自DSS迹线的总RNA提取物。这种方法已经在我们的实验室以及其他方面得到了广泛的应用（Chassaing et al。，2012，Li et al。，2016）。但是，没有尝试详细记录该程序。因此，我们详细描述了用另一种方法（Trizol，Spin柱为基础的核酸纯化）从主要从DSS处理的鼠组织中分离的总RNA的LiCl纯化步骤。
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| Quantitative Live-cell Reporter Assay for Noncanonical Wnt Activity
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] Noncanonical Wnt signaling functions independently of the β-catenin pathway to control diverse developmental processes, and dysfunction of the pathway contributes to a number of human pathological conditions, including birth defects and metastatic cancer. Progress in the field, however, has been hampered by the scarcity of functional assays for measuring noncanonical Wnt signaling activity. We recently described the Wnt5a-Ror-Kif26b (WRK) reporter assay, which directly monitors a post-transcriptional regulatory event in noncanonical Wnt signaling. In this protocol, we describe the generation of the stable GFP-Kif26b reporter cell line and a quantitative reporter assay for detecting and measuring Wnt5a signaling activities in live cells via flow cytometry.
[摘要] 非经典Wnt信号独立于β-catenin途径发挥功能来控制不同的发育过程，并且该途径的功能障碍导致许多人类病理状况，包括出生缺陷和转移性癌症。 然而，该领域的进展一直受到用于测量非典型Wnt信号活性的功能测定的稀缺性的阻碍。 我们最近描述了Wnt5a-Ror-Kif26b（WRK）记者测定法，其直接监测非典型Wnt信号传导中的转录后调节事件。 在该协议中，我们描述了通过流式细胞术检测和测量活细胞中Wnt5a信号传导活性的稳定GFP-Kif26b报告细胞系和定量记者测定法的产生。
【背景】从历史上看，转录报告基因检测方法促进了主要信号通路的描述。具体来说，β-连环蛋白依赖性萤光素酶或基于GFP的转录报道基因有助于阐明经典Wnt /β-连环蛋白途径的分子机制（Korinek et al。，1997; Fuerer and Nusse，2010）。尽管已经描述了许多基于JNK依赖性转录的非经典Wnt信号传导报道分子，但是这些转录应答是否是非经典Wnt信号传导的主要或次要仍不清楚（Veeman等，2003; Nishita等，等，2010; Ohkawara和Niehrs，2011）。此外，用于实时检测非转录性Wnt5a-Ror信号传导事件的记者尚未获得。 ...
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