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Date:
2018-02-05
[Abstract] For a complete understanding of biochemical reactions, information on complex stoichiometry is essential. However, measuring stoichiometry is experimentally challenging. Our lab has developed a FRET-based assay to study protein complex stoichiometry in vitro. This assay, also known as Job plot, is set up as a continuous variation of the molar ratio between the two species, kept at constant total concentration. The FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) between the two fluorescently-labeled proteins is measured and the stoichiometry is inferred from the sample with highest FRET signal. This approach allows us to assess complex stoichiometry in solution.
[摘要] 为了全面了解生化反应，复杂的化学计量学信息是必不可少的。 然而，测量化学计量学在实验上是具有挑战性的。 我们的实验室已经开发了基于FRET的测定法来研究蛋白质复合体化学计量体外。 该测定法也被称为作业区，其被设定为两种物质之间的摩尔比的连续变化，保持恒定的总浓度。 测量两种荧光标记蛋白之间的FRET（荧光共振能量转移），并从具有最高FRET信号的样品中推断化学计量。 这种方法使我们能够评估溶液中复杂的化学计量。
【背景】每个生物化学反应需要两种或更多种细胞组分之间的相互作用。这些相互作用的化学计量是调节细胞生物化学反应的重要因素。因此，复杂化学计量的实验确定对于充分了解细胞内工作的生物化学和生物物理学过程至关重要。
测量化学计量具有实验上的挑战性。化学计量可以通过低分辨率结构分析来推断。这些方法包括尺寸排阻色谱法，多角度光散射，分析超速离心，其能够提供粒子的精确分子量。但是，这些方法被认为是次要的。
基于FRET（荧光共振能量转移）的溶液中的化学计量。这种测定方法称为工作区（Huang，1982），可以用较少的材料进行，更适合研究任何复杂的地层，与两种成分的大小无关。在该测定中，样品保持恒定的总蛋白质浓度，但两种组分之间的摩尔比连续变化（图1）。具有复合物功能化学计量的样品希望显示最高的FRET信号。
这是获得溶液中复杂化学计量和任何大小组分之间测量的有力方法。因为FRET测量需要复合物的两个组分都被荧光标记，所以需要各种对照来排除标记过程的潜在伪影。理想的情况是单个位点的标记在该测定中是可取的（D'Arcy等人，2013; ...
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