| Quantitative Irreversible Tethering (qIT) for Target-directed Covalent Fragment Screening
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Author:
Date:
2020-12-20
[Abstract] Small molecules that react to form covalent bonds with proteins are widely used as biological tools and therapeutic agents. Screening cysteine-reactive fragments against a protein target is an efficient way to identify chemical starting points for covalent probe development. Mass spectrometry is often used to identify the site and degree of covalent fragment binding. However, robust hit identification requires characterization of the kinetics of covalent binding that can be readily achieved using quantitative irreversible tethering. This screening platform uses a non-specific cysteine-reactive fluorogenic probe to monitor the rate of reaction between covalent fragments and cysteine containing biomolecules. Fragment libraries are simultaneously screened against the target protein and ...
[摘要] [摘要]与蛋白质反应形成共价键的小分子被广泛用作生物学工具和治疗剂。筛选针对蛋白质靶标的半胱氨酸反应性片段是鉴定共价探针开发的化学起点的有效方法。质谱通常用于鉴定共价片段结合的位点和程度。然而，强大的命中鉴定需要的共价结合的动力学表征是 使用定量不可逆的网络共享可以轻松实现。该筛选平台使用非特异性的半胱氨酸反应性荧光探针来监测共价片段与含半胱氨酸的生物分子之间的反应速率。同时针对目标蛋白和作为对照的谷胱甘肽筛选片段文库，以鉴定具有动力学选择性的命中片段，以对目标进行共价修饰。通过定量不可逆的束缚进行筛选，可以解释单个片段内在反应性的变化，从而实现可靠的命中鉴定和排名。
[背景]位点定向配体发现最早在2000报道，并利用表面暴露半胱氨酸残基共价陷阱二硫键连接的片段，其结合在相邻的口袋（Erlanson等人，2000 ）。从那时起，不可逆的半胱氨酸靶向抑制剂已广泛普及，现在已成为多种肿瘤学适应症的一线治疗方法，其中值得注意的例子是针对BTK和EGFR以及以前不可药物治疗的靶标，例如KRAS（G12C）。随着这些发展，基于共价片段的配体发现已成为设计靶标特异性共价抑制剂的有效途径（Resnick et al。，2019 ...
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| FRET-based Stoichiometry Measurements of Protein Complexes in vitro
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Author:
Date:
2018-02-05
[Abstract] For a complete understanding of biochemical reactions, information on complex stoichiometry is essential. However, measuring stoichiometry is experimentally challenging. Our lab has developed a FRET-based assay to study protein complex stoichiometry in vitro. This assay, also known as Job plot, is set up as a continuous variation of the molar ratio between the two species, kept at constant total concentration. The FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) between the two fluorescently-labeled proteins is measured and the stoichiometry is inferred from the sample with highest FRET signal. This approach allows us to assess complex stoichiometry in solution.
[摘要] 为了全面了解生化反应，复杂的化学计量学信息是必不可少的。 然而，测量化学计量学在实验上是具有挑战性的。 我们的实验室已经开发了基于FRET的测定法来研究蛋白质复合体化学计量体外。 该测定法也被称为作业区，其被设定为两种物质之间的摩尔比的连续变化，保持恒定的总浓度。 测量两种荧光标记蛋白之间的FRET（荧光共振能量转移），并从具有最高FRET信号的样品中推断化学计量。 这种方法使我们能够评估溶液中复杂的化学计量。
【背景】每个生物化学反应需要两种或更多种细胞组分之间的相互作用。这些相互作用的化学计量是调节细胞生物化学反应的重要因素。因此，复杂化学计量的实验确定对于充分了解细胞内工作的生物化学和生物物理学过程至关重要。
测量化学计量具有实验上的挑战性。化学计量可以通过低分辨率结构分析来推断。这些方法包括尺寸排阻色谱法，多角度光散射，分析超速离心，其能够提供粒子的精确分子量。但是，这些方法被认为是次要的。
基于FRET（荧光共振能量转移）的溶液中的化学计量。这种测定方法称为工作区（Huang，1982），可以用较少的材料进行，更适合研究任何复杂的地层，与两种成分的大小无关。在该测定中，样品保持恒定的总蛋白质浓度，但两种组分之间的摩尔比连续变化（图1）。具有复合物功能化学计量的样品希望显示最高的FRET信号。
这是获得溶液中复杂化学计量和任何大小组分之间测量的有力方法。因为FRET测量需要复合物的两个组分都被荧光标记，所以需要各种对照来排除标记过程的潜在伪影。理想的情况是单个位点的标记在该测定中是可取的（D'Arcy等人，2013; ...
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