| Analysis of TORC1-body Formation in Budding Yeast
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Author:
Date:
2021-04-05
[Abstract] The Target of Rapamycin kinase Complex I (TORC1) is the master regulator of cell growth and metabolism in eukaryotes. In the presence of pro-growth hormones and abundant nutrients, TORC1 is active and drives protein, lipid, and nucleotide synthesis by phosphorylating a wide range of proteins. In contrast, when nitrogen and/or glucose levels fall, TORC1 is inhibited, causing the cell to switch from anabolic to catabolic metabolism, and eventually enter a quiescent state. In the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, TORC1 inhibition triggers the movement of TORC1 from its position around the vacuole to a single focus/body on the edge of the vacuolar membrane. This relocalization depends on the activity of numerous key TORC1 regulators and thus analysis of TORC1 localization can be used to ...
[摘要] [摘要]雷帕霉素激酶复合体I（TORC1）的靶标是真核生物中细胞生长和代谢的主要调节剂。在促生长激素和丰富营养素的存在下，TORC1活跃并通过磷酸化多种蛋白质来驱动蛋白质，脂质和核苷酸合成。相反，当氮和/或葡萄糖水平下降时，TORC1被抑制，导致细胞从合成代谢转换为分解代谢，并最终进入静止状态。在发芽酵母中酿酒酵母 抑制TORC1会触发TORC1从其在液泡周围的位置移动到液泡膜边缘的单个焦点/物体。这种重新定位取决于许多关键的TORC1调节子的活动，因此可以使用TORC1定位分析来跟踪通过TORC1途径发出的信号。在这里，我们提供了使用荧光显微镜测量TORC1（特别是Kog1-YFP）重新定位/信号传递的详细协议。重点放在确保以下方面的程序上：（1）尽管葡萄糖和氮饥饿期间它们相对较低的荧光和自发荧光灶的积累，但仍正确地识别（并计数）TORC1抗体；（2）在每次实验开始时，使细胞保持对数生长期，以便正确监测TORC1体形成的动力学；（3）使用适当的荧光标签来避免检查错误定位的TORC1。
[背景]雷帕霉素的靶激酶复合物I（TORC1 ）是真核生物的细胞生长控制网络中的中央轮毂（Loewith和Hall，2011;冈萨雷斯和Hall，2017; Liu和萨巴蒂尼，2020 ...
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| HIVGKO: A Tool to Assess HIV-1 Latency Reversal Agents in Human Primary CD4+ T Cells
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Date:
2018-10-20
[Abstract] While able to suppress HIV replication in HIV infected individuals, combination antiretroviral therapy (ART) fails to eliminate viral latent reservoir, which consists in integrated transcriptional silenced HIV provirus. So far, identification of latently-infected cells has relied on activating cells to induce expression of HIV proteins which can then be detected. Unfortunately, this activation significantly changed the cell phenotype. We developed a novel HIV reporter, named HIVGKO, that allows the purification of latently-infected cells in absence of reactivation. Indeed, latent cells can be identified by expression of the EF1a-driven mKO2 and lack of expression of the LTR-driven csGFP. This protocol can be used to study the effectiveness of LRAs (Latency Reversal Agents) in ...
[摘要] 虽然能够抑制HIV感染个体中的HIV复制，但联合抗逆转录病毒疗法（ART）无法消除病毒潜伏性储库，其包含整合的转录沉默的HIV原病毒。 到目前为止，潜伏感染细胞的鉴定依赖于激活细胞以诱导HIV蛋白的表达，然后可以检测到这些蛋白的表达。 不幸的是，这种激活显着改变了细胞表型。 我们开发了一种名为HIV GKO 的新型HIV报告基因，可以在没有再激活的情况下纯化潜伏感染的细胞。 实际上，可以通过EF1a驱动的mKO2的表达和LTR驱动的csGFP的缺乏表达来鉴定潜伏细胞。 该方案可用于研究LCA（潜伏期逆转剂）在原代细胞中重新激活潜伏HIV的有效性。
【背景】新版双标记病毒（HIV GKO ）含有5'LTR中HIV-1启动子控制下的密码子转换eGFP（csGFP）和一种独特的无关荧光蛋白 mKO2在细胞延伸因子αα启动子（EF1α）的控制下。 当使用与遗传相关的荧光蛋白时，由于重组问题，在这些报道分子中使用不相关的荧光蛋白是很重要的。 因此，生产性感染的细胞主要是csGFP + mKO2 + （有些可能只是GFP + ），而潜伏感染的细胞是csGFP - mKO2 + 。 流式细胞仪如分拣机AriaII允许纯化纯感染人群（生产性，潜伏性和/或未感染），而分析仪LSRII允许评估HIV GKO LTR的转录激活。 感染后的时间很短。
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| Combinations of Patch-Clamp and Confocal Calcium Imaging in Acutely Isolated Adult Mouse Amygdala Brain Slices
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Date:
2018-08-05
[Abstract] Calcium imaging is a powerful technique in the study of neuronal physiology, as it avoids the enzyme treatment on neurons and is able to study the neuronal activities in vivo. Using calcium-imaging techniques, we are able to monitor the elevation of calcium in the neuron. Furthermore, we can combine calcium imaging with other methods, like whole-cell patch clamp recordings, to detect a single cell calcium signal in brain slices. In this protocol, we describe a detailed confocal imaging method that is combined with whole-cell patch clamp configuration using brain slices (Du et al., 2017).
[摘要] 钙成像是神经生理学研究中的一项强有力的技术，因为它避免了对神经元的酶处理，并且能够研究体内的神经元活动。 使用钙成像技术，我们能够监测神经元中钙的升高。 此外，我们可以将钙成像与其他方法结合起来，如全细胞膜片钳记录，以检测脑切片中的单细胞钙信号。 在该协议中，我们描述了一种详细的共焦成像方法，该方法与使用脑切片的全细胞膜片钳配置相结合（Du et al。，2017）。
【背景】几十年来，脑切片已成功用于研究突触，神经元和神经回路。许多实验操作已经应用于脑切片模型，例如药物应用，细胞内记录和光学成像。与培养的神经元相比，脑切片保留了神经元回路的许多基本功能特性。钙成像是一种广泛使用的技术，旨在表明分离的细胞和组织的细胞内钙（Ca 2 + ）状态。研究脑组织中的细胞内钙可以深入了解各种生理过程，如细胞增殖，信号转导，突触可塑性和细胞死亡，因为钙浓度在这些功能中起着关键作用（Cameron et al。，2016）。钙指示剂是一种荧光分子，它与Ca 2 + ...
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