| Coupling Exonuclease Digestion with Selective Chemical Labeling for Base-resolution Mapping of 5-Hydroxymethylcytosine in Genomic DNA
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Author:
Date:
2018-03-05
[Abstract] This protocol is designed to obtain base-resolution information on the level of 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) in CpGs without the need for bisulfite modification. It relies on (i) the capture of hydroxymethylated sequences by a procedure known as ‘selective chemical labeling’ (see Szulwach et al., 2012) and (ii) the digestion of the captured DNA by exonucleases. After Illumina sequencing of the digested DNA fragments, an ad hoc bioinformatic pipeline extracts the information for further downstream analysis.
[摘要] 该协议旨在获得CpGs中5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）水平的碱基分辨率信息，而无需亚硫酸氢盐修饰。 它依赖于（i）通过称为“选择性化学标记”（参见Szulwach等人，2012）的方法捕获羟甲基化序列和（ii）通过外切核酸酶消化捕获的DNA。 在消化的DNA片段的Illumina测序之后，特设的生物信息学管道提取信息用于进一步的下游分析。
【背景】基因组DNA中胞嘧啶的甲基化可以被蛋白质读取，并且主要被翻译成基因沉默。基因组中的大多数CpG二核苷酸是甲基化的，包括位于基因调控区如增强子的那些。然而，当需要时，这些CpG可以通过Ten Eleven Translocation（TET）酶将甲基氧化并且通过碱基切除修复系统用未甲基化的胞嘧啶置换来去甲基化。 5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）是5-甲基胞嘧啶的第一个氧化衍生物，并且在基因组中绘制该修饰的碱基提供了关于正在进行活性去甲基化的区域的信息。尽管选择性化学标记（SCL）可以非常特异地检测5hmC，但该技术的分辨率受DNA片段大小的限制，特别是当捕获的DNA中存在多个CpG时。为了提高分辨率，我们引入了使用外切核酸酶的消化步骤，所述核酸外切酶将DNA分子修剪成靠近羟甲基化的胞嘧啶（Sérandour et。，2016）。然后对测序读数进行适当的生物信息学处理，然后将羟甲基化评分赋予捕获的CpG。
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| Characterising Maturation of GFP and mCherry of Genomically Integrated Fusions in Saccharomyces cerevisiae
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Author:
Date:
2018-01-20
[Abstract] Single-molecule fluorescence microscopy enables unrivaled sub-cellular quantitation of genomically encoded fusions of native proteins with fluorescent protein reporters. Fluorescent proteins must undergo in vivo maturation after expression before they become photoactive. Maturation effects must be quantified during single-molecule analysis. Here we present a method to characterise maturation of GFP and mCherry genetic protein fusions in budding yeast Saccharomyces cerevisiae.
[摘要] 单分子荧光显微镜技术使天然蛋白与荧光蛋白报告基因的基因组编码融合成为无与伦比的亚细胞定量。 荧光蛋白质在表达后必须进行体内成熟，然后它们变成光敏的。 成熟效应必须在单分子分析过程中进行量化。 在这里，我们提出一种方法来表征GFP和mCherry遗传蛋白融合在芽殖酵母酿酒酵母中的成熟。
【背景】单分子荧光显微技术能够灵敏定量分子化学计量，流动性和拷贝数，不仅在逐个细胞的基础上，而且精确到个别的亚细胞区室（Leake，2012; Wollman和Leake，2015; Shashkova， >等。，2017）。该技术依赖于感兴趣的野生型蛋白质的内源表达的荧光蛋白融合，从而存在一对一的标记。然而，所有荧光蛋白在进入明亮的荧光状态之前的体内成熟时间从几分钟到几十分钟不等（Badrinarayanan等人，2012）。因此，测量任何成熟效应和量化是否存在标记蛋白质的不成熟“暗部分”是最重要的。这些测量也与光漂白（FRAP）后的荧光恢复特别相关。 FRAP可用于研究活细胞中的分子转换（Beattie等人，2017）。 FRAP基于荧光标记组分定位的细胞区域的光漂白，随后定量该区域随时间的任何荧光恢复。可以使用在初始光漂白剂之后作为时间函数的荧光强度之间的测量关系来确定分子迁移率和动力学参数，例如特定荧光组分从分子复合物解离的速率（Leake等人， ...
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