| NMR waterLOGSY as An Assay in Drug Development Programmes for Detecting Protein-Ligand Interactions–NMR waterLOGSY
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Author:
Date:
2020-07-05
[Abstract] In drug development programmes, multiple assays are needed for the determination of protein-compound interactions and evaluation of potential use in assays with protein-protein interactions. In this protocol we describe the waterLOGSY NMR method for confirming protein-ligand binding events.
[摘要] [摘要] 在药物开发计划中，需要多种测定方法来测定蛋白质与化合物的相互作用，并评估在蛋白质与蛋白质相互作用中的潜在用途。在此协议中，我们描述了用于确认蛋白质-配体结合事件的waterLOGSY NMR方法。
[背景] 随着在疾病细胞中发现更多的蛋白质形式变化，药物发现计划不断增加，这些计划依赖于使用小分子文库对目标蛋白质进行初步筛选，然后进行进一步的药物化学运动以增加所散发的化学物质的效力。从屏幕上。经过初步筛选后，出现了一系列正交分析，这些化学分析有助于验证命中的化学物质，并可以对化合物进行分层，以选择最佳化合物以进入命中领先阶段，进而进行前导优化。在这些测定法是基于NMR的水大号igand ö 经由bserved ģ radient 小号pectroscop ý （waterLOGSY ）方法（Dalvit 等人，2000和2001） 。waterLOGSY 是用于检测配体的结合是特别有用的互相作用相对弱与靶蛋白（即，在μM解离常数为低毫范围），如所预期的要与初始命中从一个大的化学或片段库相关联药物化学之前先进行筛分（Lepre，2011），以提高药效和类似药物的性能。
WaterLOGSY 如何工作
该waterLOGSY 方法利用1个小分子的1 H ...
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| Characterising Maturation of GFP and mCherry of Genomically Integrated Fusions in Saccharomyces cerevisiae
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Author:
Date:
2018-01-20
[Abstract] Single-molecule fluorescence microscopy enables unrivaled sub-cellular quantitation of genomically encoded fusions of native proteins with fluorescent protein reporters. Fluorescent proteins must undergo in vivo maturation after expression before they become photoactive. Maturation effects must be quantified during single-molecule analysis. Here we present a method to characterise maturation of GFP and mCherry genetic protein fusions in budding yeast Saccharomyces cerevisiae.
[摘要] 单分子荧光显微镜技术使天然蛋白与荧光蛋白报告基因的基因组编码融合成为无与伦比的亚细胞定量。 荧光蛋白质在表达后必须进行体内成熟，然后它们变成光敏的。 成熟效应必须在单分子分析过程中进行量化。 在这里，我们提出一种方法来表征GFP和mCherry遗传蛋白融合在芽殖酵母酿酒酵母中的成熟。
【背景】单分子荧光显微技术能够灵敏定量分子化学计量，流动性和拷贝数，不仅在逐个细胞的基础上，而且精确到个别的亚细胞区室（Leake，2012; Wollman和Leake，2015; Shashkova， >等。，2017）。该技术依赖于感兴趣的野生型蛋白质的内源表达的荧光蛋白融合，从而存在一对一的标记。然而，所有荧光蛋白在进入明亮的荧光状态之前的体内成熟时间从几分钟到几十分钟不等（Badrinarayanan等人，2012）。因此，测量任何成熟效应和量化是否存在标记蛋白质的不成熟“暗部分”是最重要的。这些测量也与光漂白（FRAP）后的荧光恢复特别相关。 FRAP可用于研究活细胞中的分子转换（Beattie等人，2017）。 FRAP基于荧光标记组分定位的细胞区域的光漂白，随后定量该区域随时间的任何荧光恢复。可以使用在初始光漂白剂之后作为时间函数的荧光强度之间的测量关系来确定分子迁移率和动力学参数，例如特定荧光组分从分子复合物解离的速率（Leake等人， ...
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