In vitro assessment of ivermectin resistance and gene expression profiles of P-glycoprotein genes from Haemonchus contortus (L3)
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Author:
Date:
2020-12-20
[Abstract] The aim of the present protocol is to improve the methodology to identify resistance to ivermectin (IVM), one of the main anthelmintic drugs against parasitic nematodes of ruminants, using the blood-feeding nematode Haemonchus contortus as biological model. The infective larvae (L3) of H. contortus are frequently selected to perform in vitro and molecular assays to analyze problems with drug resistance. This protocol describes the procedures to conserve the integrity and quality of H. contortus larvae in different experimental assays. Two nematode isolates, resistant and susceptible to IVM, are compared to estimate the lethal effect using IVM at 1.43, 2.85, 5.71 and 11.42 mM dilutions in the non-ionic detergent Triton X-100 to conserve the ...
[摘要] [摘要]本协议的目的是使用血液喂养的线虫Haemonchus contortus作为生物学模型,改进鉴定对伊维菌素(IVM)的抗药性的方法,伊维菌素是针对反刍动物寄生线虫的主要驱虫药之一。的感染性幼虫(L 3 )的捻转血矛线虫,经常选择为PE rform体外和分子测定来分析与药物抗性的问题。该协议描述了保存捻转血吸虫完整性和质量的程序幼虫在不同的实验分析中。比较了两种对IVM具有抗药性和易感性的线虫分离物,以在非离子型清洁剂Triton X-100中以1.43、2.85、5.71和11.42 mM的IVM稀释度评估IVM的致死作用,以保留实验期间对照幼虫的活性。 (从24小时到72小时)。在过去的几十年中,使用IVM和其他驱虫药诊断的重要性要求确认易感菌株以评估最佳控制策略。中号矿石诊断的灵敏的方法是亲通过PCR技术和其他分子工具,如测序vided。在该方案中,使用10个主要的P-糖蛋白基因(1、2、3、4、9、10 ,11、12、14和16),使用逆转录和实时PCR(RT-qPCR),在与易受IVM侵害的线虫分离株相比,确认了捻转嗜血杆菌对IVM的抵抗力。
[背景] d ...
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Multiple Stepwise Gene Knockout Using CRISPR/Cas9 in Escherichia coli
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Author:
Date:
2018-01-20
[Abstract] With the recent implementation of the CRISPR/Cas9 technology as a standard tool for genome editing, laboratories all over the world are undergoing one of the biggest advancements in molecular biology since PCR. The key advantage of this method is its simplicity and universal applicability for species of any phylum. Of particular interest is the extensively studied Gram-negative bacterium Escherichia coli, as it is considered as the workhorse for both research and industrial purposes. Here, we present a simple, robust and effective protocol using the CRISPR/Cas9 system in combination with the λ Red machinery for gene knockout in E. coli. Crucial in our procedure is the use of a double-stranded donor DNA and a curing strategy for removal of the guide RNA encoding plasmid ...
[摘要] 随着CRISPR / Cas9技术作为基因组编辑的标准工具的最近实施,全世界的实验室正在经历PCR以来分子生物学方面最大的进步之一。这种方法的关键优点是其简单和普遍适用于任何物种的门。特别感兴趣的是广泛研究的革兰氏阴性细菌大肠杆菌,因为它被认为是研究和工业用途的主力。在这里,我们提出了一个简单,强大和有效的协议,使用CRISPR / Cas9系统结合λ红色基因敲除机器。大肠杆菌。在我们的程序中最重要的是使用双链供体DNA和固化策略来去除导向RNA编码质粒,其允许在仅仅两个工作日后开始新的突变。我们的方案允许多个具有高诱变效率的基因敲除株,适用于高通量的方法。
【背景】革兰氏阴性细菌大肠杆菌是生物技术工程中最重要的生物之一。已在能源,农业,食品生产,生物技术,医药等不同行业的各种流程中成功实施。由于不断的技术进步,生物技术部门正在迅速发展。特别是,CRISPR / Cas9技术可能是PCR(分子)生物学最大的革命(Ledford,2015)。简而言之,CRISPR / Cas9保护细菌免受诸如质粒和病毒等侵入性遗传因子的影响(Marraffini,2015)。利用这种从原核生物获得的免疫系统,已经开发了基于CRISPR / Cas9系统的基因组编辑的非常有力的工具(Jinek等人,2012)。
CRISPR / ...
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