| An ex vivo Approach to Assess Mitochondrial ROS by Flow Cytometry in AAV-tagged Astrocytes in Adult Mice
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Author:
Date:
2020-03-20
[Abstract] Mitochondrial reactive oxygen species (mROS) are naturally produced signalling molecules extremely relevant for understanding both health- and disease-associated biological processes. The study of mROS in the brain is currently underway to decipher their physiopathological roles and contributions in neurological diseases. Recent advances in this field have highlighted the importance of studying mROS signalling and redox biology at the cellular level. Neurons are especially sensitive to the harmful effects of excess mROS while astrocytic mROS have been shown to play a relevant physiological role in cerebral homeostasis and behaviour. However, given the complexity of the brain, investigating mROS formation in a specific cell-type in adult animals is methodologically challenging. Here we ...
[摘要] [摘要] 线粒体活性氧（mROS ）是天然产生的信号分子，与理解健康和疾病相关的生物过程极为相关。目前正在研究大脑中的mROS ，以了解其在神经疾病中的生理病理作用和贡献。该领域的最新进展凸显了在细胞水平研究mROS 信号传导和氧化还原生物学的重要性。神经元对过量的mROS 的有害作用特别敏感，而星形细胞的mROS对 已经显示出在脑稳态和行为中起相关的生理作用。但是，鉴于大脑的复杂性，研究成年动物中特定细胞类型中mROS的形成在方法上具有挑战性。在这里，我们提出了一种方法来具体评估星形胶质细胞中的mROS 丰度，该方法结合了i ）一种靶向策略，该策略基于在星形胶质细胞（胶质纤维酸性蛋白或GFAP）下表达绿色荧光蛋白（GFP）的腺相关病毒（AAV）载体的使用）启动子，以及ii）使用商业探针通过流式细胞术测量mROS 的强大且广泛扩展的方案。这项工作的意义在于，它允许通过易于使用的技术来选择性研究星形细胞mROS的丰度。
[背景 ] 氧化损伤与许多疾病的病因有关，包括神经退行性疾病，因为大脑是氧化应激以及与年龄相关的变化异常脆弱的组织（Cobley 等，2018; Mattson和Arumugam ...
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| Nuclear/Cytoplasmic Fractionation of Proteins from Caenorhabditis elegans
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Author:
Date:
2018-10-20
[Abstract] C. elegans is widely used to investigate biological processes related to health and disease. To study protein localization, fluorescently-tagged proteins can be used in vivo or immunohistochemistry can be performed in whole worms. Here, we describe a technique to localize a protein of interest at a subcellular level in C. elegans lysates, which can give insight into the location, function and/or toxicity of proteins.
[摘要] ℃。 线虫>广泛用于研究与健康和疾病相关的生物过程。 为了研究蛋白质定位，荧光标记的蛋白质可用于体内>或免疫组织化学可在整个蠕虫中进行。 在这里，我们描述了一种在 C中亚细胞水平定位感兴趣的蛋白质的技术。 线虫>裂解物，可以洞察蛋白质的位置，功能和/或毒性。
【背景】亚细胞分级已用于不同的模式生物中以鉴定和研究细胞核，细胞膜和细胞质中的蛋白质功能。 例如，当聚集倾向蛋白定位于细胞核或细胞质中时，它们的毒性可能更大（Kontopoulos et al。>，2006; Barmada et al。>，2010）。 在这里，我们提供了一个协议（改编自Chen et al。>，2000和La Rocca et al。>，2007）来定位的细胞核和细胞质组分中的特定蛋白质。>℃。线虫>。
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| Expression and Ni-NTA-Agarose Purification of Recombinant Hepatitis C Virus E2 Ectodomain Produced in a Baculovirus Expression System
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Author:
Date:
2018-10-05
[Abstract] In this protocol, we describe the production and purification of the ectodomain of the E2661 envelope protein (amino acids 384-661) of the Hepatitis C virus, which plays a fundamental role in the entry of the virus into the host cell. This protein has been expressed in both prokaryotic and eukaryotic systems but in small quantities or without native protein characteristics. In our case, we use the Baculovirus expression system in insect cells. E2661 is secreted into the extracellular medium and purified by means of affinity chromatography a Ni-NTA-column because the protein has a tag of six histidines at its amino terminal end. The purified protein possesses a native-like conformation and it is produced in large quantities, around 5-6 mg per liter.
[摘要] 在该协议中，我们描述了丙型肝炎病毒的E2 661 包膜蛋白（氨基酸384-661）的胞外域的产生和纯化，其在病毒进入中起基础作用。 进入宿主细胞。 该蛋白质已经在原核和真核系统中表达，但是少量或没有天然蛋白质特征。 在我们的例子中，我们在昆虫细胞中使用杆状病毒表达系统。 E2 661 被分泌到细胞外培养基中并通过亲和层析Ni-NTA-柱纯化，因为该蛋白质在其氨基末端具有六个组氨酸的标签。 纯化的蛋白质具有天然样构象，并且大量生产，每升约5-6mg。
【背景】丙型肝炎病毒（HCV）是全世界慢性肝炎，肝硬化和肝细胞癌的主要原因（Major et al。，2001; Alter，2006）。此时，没有HCV疫苗，抗病毒药物用于治疗HCV感染（Imran et al。，2014）。然而，治疗费用昂贵且不是100％有效（Kohli et al。，2014）。 HCV包膜糖蛋白E2负责与细胞受体的相互作用，因此它是研究病毒感染周期的第一步的主要候选者。由于糖基化和聚集，先前的表达系统产生低水平的异质蛋白质，并且难以区分经历生产性和非生产性折叠的分子（Flint ...
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