| Preparation and Purification of Proteins Secreted from Phytophthora sojae
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Author:
Date:
2018-10-20
[Abstract] Phytophthora sojae, the causal agent of soybean root and stem rot, is responsible for enormous economic losses in soybean production. P. sojae secrets various effectors to reprogram host immunity. The plant apoplastic space is a major battleground in plant-pathogen interactions. Here we describe a protocol for purification and isolation of secreted proteins from P. sojae, including precipitation of secreted proteins from P. sojae culture filtrate, chromatographic purification of the secreted proteins and analysis of the proteins by Mass spectrometry. With this protocol, it will be easier to identify potential apoplastic effectors in Phytophthora and will benefit our understanding of plant-microbe interactions.
[摘要] 大豆根和茎腐病的致病因子大豆疫霉（Phytophthora sojae）是造成大豆生产的巨大经济损失的原因。 P上。 sojae >秘密各种效应器重新编程宿主免疫力。植物质外体空间是植物 - 病原体相互作用的主要战场。在这里，我们描述了从 P中纯化和分离分泌蛋白的方案。 sojae >，包括来自 P的分泌蛋白的沉淀。 sojae >培养滤液，分泌蛋白的色谱纯化和质谱分析蛋白质。通过该协议，可以更容易地鉴定 Phytophthora >中潜在的质外体效应物，并有助于我们对植物 - 微生物相互作用的理解。
【背景】从 Phytophthora >物种中分泌的蛋白质的纯化对于理解 Phytophthora >发病机理至关重要。过去，V8果汁和植物（番茄和利马豆）果汁培养基已用于培养 Phytophthora >，培养物过滤后用于分析 Phytophthora >分泌的蛋白质。这些方案的缺点是培养基含有大量的植物蛋白，它们代表了大部分检测到的蛋白质。在该方案中，我们使用了不含任何蛋白质的合成液体培养基。该培养基显着降低了 Phytophthora >培养滤液的背景。此外，利用凝胶过滤脱盐和筛分柱代替离子交换柱，可以有效和大规模纯化 Phytophthora >分泌的蛋白质。
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| Nuclear/Cytoplasmic Fractionation of Proteins from Caenorhabditis elegans
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Author:
Date:
2018-10-20
[Abstract] C. elegans is widely used to investigate biological processes related to health and disease. To study protein localization, fluorescently-tagged proteins can be used in vivo or immunohistochemistry can be performed in whole worms. Here, we describe a technique to localize a protein of interest at a subcellular level in C. elegans lysates, which can give insight into the location, function and/or toxicity of proteins.
[摘要] ℃。 线虫>广泛用于研究与健康和疾病相关的生物过程。 为了研究蛋白质定位，荧光标记的蛋白质可用于体内>或免疫组织化学可在整个蠕虫中进行。 在这里，我们描述了一种在 C中亚细胞水平定位感兴趣的蛋白质的技术。 线虫>裂解物，可以洞察蛋白质的位置，功能和/或毒性。
【背景】亚细胞分级已用于不同的模式生物中以鉴定和研究细胞核，细胞膜和细胞质中的蛋白质功能。 例如，当聚集倾向蛋白定位于细胞核或细胞质中时，它们的毒性可能更大（Kontopoulos et al。>，2006; Barmada et al。>，2010）。 在这里，我们提供了一个协议（改编自Chen et al。>，2000和La Rocca et al。>，2007）来定位的细胞核和细胞质组分中的特定蛋白质。>℃。线虫>。
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| Overcoming Autofluorescence to Assess GFP Expression During Normal Physiology and Aging in Caenorhabditis elegans
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Author:
Date:
2018-07-20
[Abstract] Green fluorescent protein (GFP) is widely used as a molecular tool to assess protein expression and localization. In C. elegans, the signal from weakly expressed GFP fusion proteins is masked by autofluorescence emitted from the intestinal lysosome-related gut granules. For instance, the GFP fluorescence from SKN-1 transcription factor fused to GFP is barely visible with common GFP (FITC) filter setups. Furthermore, this intestinal autofluorescence increases upon heat stress, oxidative stress (sodium azide), and during aging, thereby masking GFP expression even from proximal tissues. Here, we describe a triple band GFP filter setup that separates the GFP signal from autofluorescence, displaying GFP in green and autofluorescence in yellow. In addition, yellow fluorescent protein ...
[摘要] 绿色荧光蛋白（GFP）被广泛用作评估蛋白质表达和定位的分子工具。在 C中。线虫，来自弱表达的GFP融合蛋白的信号被肠溶酶体相关肠道颗粒发出的自发荧光掩盖。例如，使用常见的GFP（FITC）过滤器设置几乎看不到融合到GFP的SKN-1转录因子的GFP荧光。此外，这种肠自发荧光在热应激，氧化应激（叠氮化钠）和衰老过程中增加，从而甚至从近端组织掩蔽GFP表达。在这里，我们描述了一个三频段GFP滤波器设置，将GFP信号与自发荧光分开，显示绿色GFP和黄色自发荧光。此外，黄色荧光蛋白（YFP）仍然可以与黄色自发荧光和GFP区别开来，这种三重带滤光器设置。虽然使用三频段GFP过滤器设置可能会损失一些GFP强度，但优点是不需要修改当前使用的转基因GFP系列，并且这些GFP过滤器易于安装。因此，通过使用这种三重带GFP过滤器设置，研究人员可以轻松地将自发荧光与其最喜欢的转基因 C中的GFP和YFP区分开来。线虫线。
【背景】自发荧光的主要来源包括细胞内溶酶体衍生的颗粒，线粒体（即，自发荧光分子如NAD（P）H和黄素）或细胞外胶原蛋白（Hermann 等。 ，2005; Monici，2005）。在老化过程中，自发荧光材料如脂褐素和晚期糖基化终产物（AGE）积聚。在线虫 C.线虫，肠道颗粒的自发荧光在胚胎发生过程中已经开始，反映了溶酶体相关细胞器的生物发生（Hermann ...
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