| Detection of Protein Interactions in the Cytoplasm and Periplasm of Escherichia coli by Förster Resonance Energy Transfer
|
|
Author:
Date:
2018-01-20
[Abstract] This protocol was developed to qualitatively and quantitatively detect protein-protein interactions in Escherichia coli by Förster Resonance Energy Transfer (FRET). The described assay allows for the previously impossible in vivo screening of periplasmic protein-protein interactions. In FRET, excitation of a donor fluorescent molecule results in the transfer of energy to an acceptor fluorescent molecule, which will then emit light if the distance between them is within the 1-10 nm range. Fluorescent proteins can be genetically encoded as fusions to proteins of interest and expressed in the cell and therefore FRET protein-protein interaction experiments can be performed in vivo. Donor and acceptor fluorescent protein fusions are constructed for bacterial proteins ...
[摘要] 该协议的开发是通过Förster共振能量转移（FRET）定性和定量检测大肠杆菌中的蛋白质 - 蛋白质相互作用。所描述的测定允许以前不可能的周质蛋白质 - 蛋白质相互作用的体内筛选。在FRET中，供体荧光分子的激发导致能量转移到受体荧光分子，如果它们之间的距离在1-10nm范围内，则受体荧光分子将发光。荧光蛋白质可以被遗传编码为与感兴趣的蛋白质的融合物并且在细胞中表达，因此FRET蛋白质 - 蛋白质相互作用实验可以在体内进行。供体和受体荧光蛋白融合体被构建用于被怀疑相互作用的细菌蛋白质。这些融合蛋白在细菌细胞中共表达，随后激发供体和受体通道测量荧光发射光谱。供体的发射光谱与受体的激发光谱之间的部分重叠是FRET的先决条件。即使在没有FRET的情况下，供体激发也可以使受体以已知百分比交叉激发。通过测量背景，仅供体和仅受体样品的参考光谱，可以计算预期的发射光谱。在预期光谱之上的受体的致敏发射可以归因于FRET，并且可以通过光谱解混来量化。
【背景】确定如何和哪些蛋白质相互作用维持生命是分子生物学研究的核心。存在许多体外方法，但可能导致误报，因为相互作用是从其生物学背景中取出的。 ...
|
|
|
| Infectious Subviral Particle-induced Hemolysis Assay for Mammalian Orthoreovirus
|
|
Author:
Date:
2018-01-20
[Abstract] Mammalian orthoreovirus (reovirus) utilizes pore forming peptides to penetrate host cell membranes. This step is essential for delivering its genome containing core particle during viral entry. This protocol describes an in vitro assay for measuring reovirus-induced pore formation.
[摘要] 哺乳动物正面病毒（呼肠孤病毒）外壳在病毒进入之前或过程中经历一系列构象变化。 这些转换对于跨宿主细胞膜递送含基因组的核心是必要的。 该协议描述了用于监测向膜渗透活性形式（即，ISVP *）的转变的体外试验。
【背景】呼肠孤病毒是无包膜的双链RNA病毒，其由两个同心蛋白质壳组成：内衣壳（核心）和外衣壳（Dryden等人，1993; Zhang等人， / ，2005; Dermody et al ，2013）。在附着之后，病毒颗粒被内吞（Borsa et al。，1979; Ehrlich et al。，2004; Maginnis et al。，2006; Maginnis和宿主组织蛋白酶蛋白酶降解σ3外壳蛋白（Chang和Zweerink，1971; Silverstein等人，1972; Borsa等人，et al。 1981; Sturzenbecker等人，1987; Dermody等人，1993; Baer和Dermody，1997; Ebert等人， 2002年）。这个过程产生一个亚稳中间体，称为感染性亚病毒颗粒（ISVP），其中细胞穿透蛋白μ1被暴露（Dryden等人，1993）。 ISVPs是通过用糜蛋白酶处理纯化的病毒体而在体外产生的（Joklik，1972; ...
|
|
|