| Native Co-immunoprecipitation Assay to Identify Interacting Partners of Chromatin-associated Proteins in Mammalian Cells
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Author:
Date:
2020-12-05
[Abstract] Protein-protein interactions play key roles in nuclear processes including transcription, replication, DNA damage repair, and recombination. Co-immunoprecipitation (Co-IP) followed by western blot or mass spectrometry is an invaluable approach to identify protein-protein interactions. One of the challenges in the Co-IP of a protein localized to nucleus is the extraction of nuclear proteins from sub-nuclear fractions without losing physiologically relevant protein interactions. Here we describe a protocol for native Co-IP, which was originally used to successfully identify previously known as well novel topoisomerase 1 (TOP1) interacting proteins. In this protocol, we first extracted nuclear proteins by sequentially increasing detergent and salt concentrations, the extracted fractions were ...
[摘要] [摘要]蛋白质间相互作用 在核过程中起关键作用，包括转录，复制，DNA损伤修复和重组。免疫共沉淀（Co-IP），然后进行蛋白质印迹或质谱分析是鉴定蛋白质-蛋白质相互作用的宝贵方法。在Co-IP中定位于细胞核的蛋白质中的挑战之一是从亚核级分中提取核蛋白质，而又不会失去生理上相关的蛋白质相互作用。在这里，我们描述了一种用于天然Co-IP的协议，该协议最初用于成功地识别以前称为新拓扑拓扑异构酶1（TOP1）相互作用的蛋白质。在此协议中，我们首先通过依次增加去污剂和盐浓度来提取核蛋白，然后将提取的级分稀释，合并并用于Co-IP。该协议可用于鉴定多种哺乳动物细胞中其他染色质相关蛋白的蛋白相互作用组。
背景]钴- IP被广泛地被使用，以解开的错综复杂的关系之间的蛋白复合物和各种染色质交易期间的复制，转录，和基因组的维护。但是，它是具有挑战性的，以保持不稳定的蛋白质-蛋白质相互作用的完整过程中提取，免疫沉淀和一个共同的IP实验的洗涤步骤。稳定不稳定蛋白质相互作用的一种方法是在细胞裂解之前用细胞可渗透的可逆化学交联剂（例如丙酸二硫代双琥珀酰亚胺酯）处理细胞（Smith等人，2011）。由于该方法伴随着诸如提取效率低和非特异性蛋白质捕获之类的缺点，因此优选不交联的Co-IP（天然IP）。
一核蛋白质可以被分配到不同的子-核舱或染色质区域是需要不同程度的严格性为它的提取和溶解。对于例如，TOP ...
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| Visible Immunoprecipitation (VIP) Assay: a Simple and Versatile Method for Visual Detection of Protein-protein Interactions
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Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] The visible immunoprecipitation (VIP) assay is a convenient alternative to conventional co-immunoprecipitation (Katoh et al., 2015). By processing lysates from cells co-expressing GFP-fusion and RFP-fusion proteins for immunoprecipitation with GST-tagged anti-GFP Nanobody and glutathione-Sepharose beads, protein-protein interactions can be visualized by directly observing the beads bearing immunoprecipitates under a fluorescence microscope. This assay can examine a large number of protein combinations at one time, without requiring time-consuming procedures, including SDS-PAGE and immunoblotting. Furthermore, the VIP assay can examine complicated one-to-many and many-to-many protein interactions. Another important point of the VIP assay is the use of nanobodies for ...
[摘要] 可见的免疫沉淀（VIP）测定是常规免疫共沉淀的方便的替代方法（Katoh等人，2015）。通过处理来自共表达GFP融合蛋白和RFP融合蛋白的细胞的裂解物以用GST标记的抗GFP纳米抗体和谷胱甘肽琼脂糖珠粒进行免疫沉淀，可以通过在荧光显微镜下直接观察带有免疫沉淀物的珠来显现蛋白质 - 蛋白质相互作用。该检测方法可以一次检测大量的蛋白质组合，无需耗时的操作，包括SDS-PAGE和免疫印迹。此外，VIP测定可以检查复杂的一对多和多对多的蛋白质相互作用。 VIP测定的另一个重要的点是使用纳米抗体进行免疫沉淀。纳米抗体是来自骆驼科（骆驼和亲戚）的单域抗体。由于其体积小，高亲和力，高特异性和稳定性，因此在E中表达的抗GFP纳米抗体。大肠杆菌可以大规模纯化，并且实际上用于免疫沉淀实验。在这里，我们描述了制备GST标记的抗GFP纳米抗体和VIP测定的方案。
【背景】细胞中的几乎所有蛋白质都通过与其他蛋白质相互作用起作用。揭示蛋白质 - 蛋白质相互作用网络是了解蛋白质功能的关键。已经开发了多种方法，例如酵母双杂交系统，GST pull-down和免疫共沉淀来分析蛋白质 - 蛋白质相互作用。最近，我们开发了一种称为可见免疫沉淀（VIP）测定的蛋白质 - 蛋白质相互作用分析的新方法（Katoh等人，2015）。 ...
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