| Determination of Flavin Potential in Proteins by Xanthine/Xanthine Oxidase Method
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Author:
Date:
2020-04-05
[Abstract] This protocol describes a simple xanthine/xanthine oxidase enzymatic equilibration method for determination of the redox potential of a flavin. As an example of the use of this method, we determine the reduction potential of the covalently bound FAD cofactor (Em = -55 mV) in the SdhA flavoprotein subunit of succinate dehydrogenase from Escherichia coli. In principle, this method can be used routinely to determine the redox potential of flavin cofactors in any simple flavoprotein from equilibrium concentrations with an appropriate reference dye of known Em without the use of sophisticated electrochemical equipment.
[摘要] [摘要] 该协议描述了一种简单的黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶酶平衡方法，用于测定黄素的氧化还原电位。作为使用此方法的一个例子，我们确定了大肠杆菌中琥珀酸脱氢酶的SdhA 黄素亚基中共价结合的FAD辅因子的还原电位（E m = -55 mV）。原则上，该方法可常规用于通过平衡浓度和已知E m 的适当参考染料确定任何简单黄素蛋白中黄素辅因子的氧化还原电位。 无需使用复杂的电化学设备。
[背景] 几种生物物理方法可用于测量蛋白质中黄素的还原中点电位（E m ）。这些电位测量方法通常依赖于目标蛋白质和电极之间的电化学偶联。例如，在带有其他辅助因子（例如铁硫中心和醌）的复杂黄素蛋白中，常常使用电化学方法和电子顺磁共振（EPR）光谱来确定氧化还原中心的E m （Kowal 等，1995；Saenger等，等人，2005； Hudson 等人，2005； Cheng 等人，2015）。然而，在只包含黄素氧化还原中心简单黄素蛋白，辅助因子，可以直接通过它不需要特殊的设备电化学或昂贵的EPR仪表传统光学分光光度法研究。1990年，文森特·梅西（Vincent Massey）提出了一种简单的方法，该方法可以从氧化和还原伴侣（即黄素蛋白和参考染料）的平衡浓度中确定黄素的还原电位（Massey，1991）。该方法不直接测量黄素的还原电势，而是确定黄素和参考染料的E m ...
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| Registration and Alignment Between in vivo Functional and Cytoarchitectonic Maps of Mouse Visual Cortex
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Author:
Date:
2018-02-20
[Abstract] This protocol describes a method for registration of in vivo cortical retinotopic map with cytochrome c oxidase (CO) labeled architectonic maps of the same mouse brain through the alignment of vascular fiducials. By recording surface blood vessel pattern and sequential alignment at each step, this method overcomes the challenge imposed by tissue distortion during perfusion, mounting, sectioning and histology procedures. This method can also be generalized to register and align other types of in vivo functional maps like ocular dominance map and spatial/temporal frequency tuning map with various anatomical maps of mouse cortex.
[摘要] 该协议描述了通过血管基准点的对齐使用细胞色素c氧化酶（CO）标记的相同小鼠脑的构建图来注册体内皮质视网膜地图的方法。 通过记录每个步骤的表面血管图案和顺序对准，该方法克服了在灌注，贴壁，切片和组织学程序期间由组织变形所施加的挑战。 这种方法也可以推广到注册和对齐其他类型的体内功能地图，如眼优势地图和空间/时间频率调整地图与小鼠皮层的各种解剖图。
【背景】通过体内视网膜映射（Marshel等人，2011; Garrett等人，），可以将小鼠视觉皮层分隔成功能上不同的视觉区域。 （Olavarria and Montero，1989; Wang and Burkhalter，2007），或者通过建筑结构辅助的神经元追踪技术，这些不同的视觉区域具有不同的响应特性和皮质皮质连接（Andermann等人，2011; Marshel等人，2011; Roth等人， >，2012; Wang等人，2011和2012）。这些结果表明，鼠标视觉区域形成处理不同类型的视觉信息的分离的视觉流（Murakami等人，2017; Smith等人，2017）。在视觉区域地图的背景下研究鼠标视觉系统对于理解视觉皮层的组织是至关重要的。然而，虽然功能图和结构图大致相似，但是这两幅图显示的并不完美（Zhuang et ...
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| Detection of Intracellular Reduced (Catalytically Active) SHP-1 and Analyses of Catalytically Inactive SHP-1 after Oxidation by Pervanadate or H2O2
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Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] Oxidative inactivation of cysteine-dependent Protein Tyrosine Phosphatases (PTPs) by cellular reactive oxygen species (ROS) plays a critical role in regulating signal transduction in multiple cell types. The phosphatase activity of most PTPs depends upon a ‘signature’ cysteine residue within the catalytic domain that is maintained in the de-protonated state at physiological pH rendering it susceptible to ROS-mediated oxidation. Direct and indirect techniques for detection of PTP oxidation have been developed (Karisch and Neel, 2013). To detect catalytically active PTPs, cell lysates are treated with iodoacetyl-polyethylene glycol-biotin (IAP-biotin), which irreversibly binds to reduced (S-) cysteine thiols. Irreversible oxidation of SHP-1 after treatment of cells with ...
[摘要] 细胞活性氧（ROS）对半胱氨酸依赖性蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）的氧化失活在调节多种细胞类型的信号转导中起关键作用。大多数PTP的磷酸酶活性取决于催化结构域内的“标记”半胱氨酸残基，其在生理pH下保持质子化状态，使其易受ROS介导的氧化。已经开发了用于检测PTP氧化的直接和间接技术（Karisch和Neel，2013）。为了检测催化活性的PTP，用碘乙酰 - 聚乙二醇 - 生物素（IAP-生物素）处理细胞裂解物，所述碘乙酰 - 聚乙二醇 - 生物素（IAP-生物素）不可逆地结合还原的（S-5）半胱氨酸硫醇。使用对磺酸（SO 3）特异性的抗体检测用过钒酸盐或H 2 O 2 2处理细胞后SHP-1的不可逆氧化， H）形式的PTP的保守的活性位点半胱氨酸。在该协议中，我们描述了用于检测造血PTP SHP的还原（S ; active）或不可逆氧化（SO 3 H;非活性）形式的方法-1，尽管这种方法适用于任何细胞类型中的任何半胱氨酸依赖性PTP。
【背景】活性氧（ROS）由细胞NADPH氧化酶和线粒体产生。大多数蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTP）含有保守的催化半胱氨酸，其具有低的解离常数（pKa），其对ROS的氧化非常敏感（Rudyk和Eaton，2014）。 PTP的ROS失活在许多细胞类型中调节酪氨酸激酶介导的信号传导反应中起重要作用。在用ROS H 2 O ...
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