| Preparation of a Bacteriophage T4-based Prokaryotic-eukaryotic Hybrid Viral Vector for Delivery of Large Cargos of Genes and Proteins into Human Cells
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Author:
Date:
2020-04-05
[Abstract] A viral vector that can safely and efficiently deliver large and diverse molecular cargos into cells is the holy grail of curing many human diseases. Adeno-associated virus (AAV) has been extensively used but has a very small capacity. The prokaryotic virus T4 has a large capacity but lacks natural mechanisms to enter mammalian cells. Here, we created a hybrid vector by combining T4 and AAV into one nanoparticle that possesses the advantages of both. The small 25 nm AAV particles are attached to the large 120 nm x 86 nm T4 head through avidin-biotin cross-bridges using the phage decoration proteins Soc (small outer capsid protein) and Hoc (highly antigenic outer capsid protein). AAV thus “piggy-backed” on T4 capsid, by virtue of its natural ability to enter many types of human cells ...
[摘要] [摘要 ] 一种病毒载体，可以安全有效地将大量多样的分子货物运送到细胞中 是治愈许多人类疾病的圣杯。腺伴随病毒（AAV）已被广泛使用，但容量很小。T4原核病毒容量大，但缺乏进入哺乳动物细胞的天然机制。在这里，我们通过将T4和AAV结合到一个具有两者优势的纳米颗粒中，创建了一种杂交载体。使用噬菌体修饰蛋白Soc（小的外衣壳蛋白）和Hoc（高度抗原化的外衣壳蛋白），通过亲和素-生物素交叉桥将25 nm的AAV小颗粒连接到120 nm x 86 nm的大T4头上。因此，AAV凭借其固有的进入多种类型人体细胞的自然能力，可以“背负”于T4衣壳上，从而有效地充当了“驱动器”，以运送与T4头相关的大型货物。这种独特的T4-AAV杂交载体方法可为将来开发新型疗法铺平道路。
[背景 ] 已经有新的和有效的递送载体能够运输基因和蛋白质的大货物进入人类细胞，以刺激生产治疗性生物分子的和/或修复的细胞和遗传缺陷的迫切需要。这样的载体将允许将快速出现的技术（例如CRISPR，CAR T细胞等）转化为用于大规模应用以及个性化医学的疗法（Stewart 等，2016）。
将具有不同特性的纳米粒子组装到杂化复合物中是开发新型功能材料的有力策略，因为这些杂化复合物显示出集体和协作的属性，其中某些属性可能与单个粒子所显示的属性不同（Ghosh 等人，2012； ...
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| Detection of Intracellular Reduced (Catalytically Active) SHP-1 and Analyses of Catalytically Inactive SHP-1 after Oxidation by Pervanadate or H2O2
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Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] Oxidative inactivation of cysteine-dependent Protein Tyrosine Phosphatases (PTPs) by cellular reactive oxygen species (ROS) plays a critical role in regulating signal transduction in multiple cell types. The phosphatase activity of most PTPs depends upon a ‘signature’ cysteine residue within the catalytic domain that is maintained in the de-protonated state at physiological pH rendering it susceptible to ROS-mediated oxidation. Direct and indirect techniques for detection of PTP oxidation have been developed (Karisch and Neel, 2013). To detect catalytically active PTPs, cell lysates are treated with iodoacetyl-polyethylene glycol-biotin (IAP-biotin), which irreversibly binds to reduced (S-) cysteine thiols. Irreversible oxidation of SHP-1 after treatment of cells with ...
[摘要] 细胞活性氧（ROS）对半胱氨酸依赖性蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）的氧化失活在调节多种细胞类型的信号转导中起关键作用。大多数PTP的磷酸酶活性取决于催化结构域内的“标记”半胱氨酸残基，其在生理pH下保持质子化状态，使其易受ROS介导的氧化。已经开发了用于检测PTP氧化的直接和间接技术（Karisch和Neel，2013）。为了检测催化活性的PTP，用碘乙酰 - 聚乙二醇 - 生物素（IAP-生物素）处理细胞裂解物，所述碘乙酰 - 聚乙二醇 - 生物素（IAP-生物素）不可逆地结合还原的（S-5）半胱氨酸硫醇。使用对磺酸（SO 3）特异性的抗体检测用过钒酸盐或H 2 O 2 2处理细胞后SHP-1的不可逆氧化， H）形式的PTP的保守的活性位点半胱氨酸。在该协议中，我们描述了用于检测造血PTP SHP的还原（S ; active）或不可逆氧化（SO 3 H;非活性）形式的方法-1，尽管这种方法适用于任何细胞类型中的任何半胱氨酸依赖性PTP。
【背景】活性氧（ROS）由细胞NADPH氧化酶和线粒体产生。大多数蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTP）含有保守的催化半胱氨酸，其具有低的解离常数（pKa），其对ROS的氧化非常敏感（Rudyk和Eaton，2014）。 PTP的ROS失活在许多细胞类型中调节酪氨酸激酶介导的信号传导反应中起重要作用。在用ROS H 2 O ...
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