| Analysis of Direct Interaction between Viral DNA-binding Proteins by Protein Pull-down Co-immunoprecipitation Assay
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Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] This protocol analyzes the direct interaction between two DNA-binding proteins by pull-down co-immunoprecipitation. One of the proteins is overexpressed in E. coli as HA-tagged recombinant protein and cell-free extracts are immunoprecipitated in HA-affinity resin. Cell extracts are treated with nuclease to degrade DNA and RNA, which rules out nucleic acid-mediated indirect interaction. Then, a second immunoprecipitation step is performed using the purified putative partner protein. Co-immunoprecipitated proteins can be detected either by Coomassie Blue staining and/or Western blotting (WB) if a specific antibody is available. Moreover, many DNA/RNA binding proteins are highly electropositive, which can hinder WB under standard conditions, as has been shown in histones and ...
[摘要] 该协议通过下拉共免疫沉淀分析两种DNA结合蛋白之间的直接相互作用。其中一种蛋白在E中过表达。如HA标记的重组蛋白和无细胞提取物在HA亲和树脂中免疫沉淀。用核酸酶处理细胞提取物以降解DNA和RNA，这排除了核酸介导的间接相互作用。然后，使用纯化的推定的配偶体蛋白进行第二次免疫沉淀步骤。如果特异性抗体可用，可以通过考马斯蓝染色和/或Western印迹（WB）检测免疫共沉淀蛋白质。此外，许多DNA / RNA结合蛋白具有高度正电性，在标准条件下可阻碍WB，正如组蛋白和组蛋白样蛋白所示。在这种情况下，我们表明，假定的合作伙伴的高等电点导致转移不良。提示麻烦WB提供高正电荷DNA结合蛋白的转移。
【背景】共免疫沉淀是分析蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）的常用方法。许多共免疫沉淀方案使用细菌表达的蛋白质。然而，细胞提取物的使用不排除由第三种蛋白介导的间接相互作用，或者在DNA / RNA结合蛋白的情况下介导核酸。
乙型病毒Bam35（B35TP）的末端蛋白含有保守的酪氨酸194，其提供OH基团以在蛋白质引发的DNA复制期间锚定病毒基因组的第一个5'-dTMP。此外，B35TP具有很强的DNA结合能力，与许多DNA结合蛋白一样，它具有非常高的等电点（约10.6），这影响其体外稳定性和功能（Berjón-Otero 等），2016）。 ...
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| Detection of Intracellular Reduced (Catalytically Active) SHP-1 and Analyses of Catalytically Inactive SHP-1 after Oxidation by Pervanadate or H2O2
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Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] Oxidative inactivation of cysteine-dependent Protein Tyrosine Phosphatases (PTPs) by cellular reactive oxygen species (ROS) plays a critical role in regulating signal transduction in multiple cell types. The phosphatase activity of most PTPs depends upon a ‘signature’ cysteine residue within the catalytic domain that is maintained in the de-protonated state at physiological pH rendering it susceptible to ROS-mediated oxidation. Direct and indirect techniques for detection of PTP oxidation have been developed (Karisch and Neel, 2013). To detect catalytically active PTPs, cell lysates are treated with iodoacetyl-polyethylene glycol-biotin (IAP-biotin), which irreversibly binds to reduced (S-) cysteine thiols. Irreversible oxidation of SHP-1 after treatment of cells with ...
[摘要] 细胞活性氧（ROS）对半胱氨酸依赖性蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）的氧化失活在调节多种细胞类型的信号转导中起关键作用。大多数PTP的磷酸酶活性取决于催化结构域内的“标记”半胱氨酸残基，其在生理pH下保持质子化状态，使其易受ROS介导的氧化。已经开发了用于检测PTP氧化的直接和间接技术（Karisch和Neel，2013）。为了检测催化活性的PTP，用碘乙酰 - 聚乙二醇 - 生物素（IAP-生物素）处理细胞裂解物，所述碘乙酰 - 聚乙二醇 - 生物素（IAP-生物素）不可逆地结合还原的（S-5）半胱氨酸硫醇。使用对磺酸（SO 3）特异性的抗体检测用过钒酸盐或H 2 O 2 2处理细胞后SHP-1的不可逆氧化， H）形式的PTP的保守的活性位点半胱氨酸。在该协议中，我们描述了用于检测造血PTP SHP的还原（S ; active）或不可逆氧化（SO 3 H;非活性）形式的方法-1，尽管这种方法适用于任何细胞类型中的任何半胱氨酸依赖性PTP。
【背景】活性氧（ROS）由细胞NADPH氧化酶和线粒体产生。大多数蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTP）含有保守的催化半胱氨酸，其具有低的解离常数（pKa），其对ROS的氧化非常敏感（Rudyk和Eaton，2014）。 PTP的ROS失活在许多细胞类型中调节酪氨酸激酶介导的信号传导反应中起重要作用。在用ROS H 2 O ...
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