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Date:
2018-01-05
[Abstract] This protocol analyzes the direct interaction between two DNA-binding proteins by pull-down co-immunoprecipitation. One of the proteins is overexpressed in E. coli as HA-tagged recombinant protein and cell-free extracts are immunoprecipitated in HA-affinity resin. Cell extracts are treated with nuclease to degrade DNA and RNA, which rules out nucleic acid-mediated indirect interaction. Then, a second immunoprecipitation step is performed using the purified putative partner protein. Co-immunoprecipitated proteins can be detected either by Coomassie Blue staining and/or Western blotting (WB) if a specific antibody is available. Moreover, many DNA/RNA binding proteins are highly electropositive, which can hinder WB under standard conditions, as has been shown in histones and ...
[摘要] 该协议通过下拉共免疫沉淀分析两种DNA结合蛋白之间的直接相互作用。其中一种蛋白在E中过表达。如HA标记的重组蛋白和无细胞提取物在HA亲和树脂中免疫沉淀。用核酸酶处理细胞提取物以降解DNA和RNA，这排除了核酸介导的间接相互作用。然后，使用纯化的推定的配偶体蛋白进行第二次免疫沉淀步骤。如果特异性抗体可用，可以通过考马斯蓝染色和/或Western印迹（WB）检测免疫共沉淀蛋白质。此外，许多DNA / RNA结合蛋白具有高度正电性，在标准条件下可阻碍WB，正如组蛋白和组蛋白样蛋白所示。在这种情况下，我们表明，假定的合作伙伴的高等电点导致转移不良。提示麻烦WB提供高正电荷DNA结合蛋白的转移。
【背景】共免疫沉淀是分析蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）的常用方法。许多共免疫沉淀方案使用细菌表达的蛋白质。然而，细胞提取物的使用不排除由第三种蛋白介导的间接相互作用，或者在DNA / RNA结合蛋白的情况下介导核酸。
乙型病毒Bam35（B35TP）的末端蛋白含有保守的酪氨酸194，其提供OH基团以在蛋白质引发的DNA复制期间锚定病毒基因组的第一个5'-dTMP。此外，B35TP具有很强的DNA结合能力，与许多DNA结合蛋白一样，它具有非常高的等电点（约10.6），这影响其体外稳定性和功能（Berjón-Otero 等），2016）。 ...
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