| Heterologous Expression and Purification of SARS-CoV2 Nucleocapsid Protein
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Author:
Date:
2020-08-05
[Abstract] This protocol describes a step by step method for heterologous expression of SARS-CoV2 Nucleocapsid (N) protein in Escherichia coli. Moreover, this protocol includes steps to purify the N protein to high purity and homogeneity. Thus, purified protein can be used for ligand binding assays and other biochemical experiments.
[摘要] [摘要]该方案描述了一种逐步在大肠杆菌中异源表达SARS-CoV2核衣壳（N）蛋白的方法。此外，该方案包括纯化N蛋白以获得高纯度和均一性的步骤。因此，纯化后的蛋白质可用于配体结合分析和其他生化实验。
[] 自2019年底在中国武汉姆被发现以来，SARS-CoV2感染在世界各地肆虐（Wu等人，2020年）。为了跟踪早期感染的进程，在血清学检测中，核衣壳蛋白（N）与棘突蛋白（S）一起用于监测纽约地区早期感染的进程。N是病毒蛋白中最高表达的一种，因此是一个很好的靶点。为了便于这些分析，我们开发了一个纯化方案，并成功地用于这些研究。
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| Heterologous Expression and Purification of SARS-CoV2 Nucleocapsid Protein
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Author:
Date:
2020-08-05
[Abstract] This protocol describes a step by step method for heterologous expression of SARS-CoV2 Nucleocapsid (N) protein in Escherichia coli. Moreover, this protocol includes steps to purify the N protein to high purity and homogeneity. Thus, purified protein can be used for ligand binding assays and other biochemical experiments.
[摘要] [摘要]该方案描述了一种逐步在大肠杆菌中异源表达SARS-CoV2核衣壳（N）蛋白的方法。此外，该方案包括纯化N蛋白以获得高纯度和均一性的步骤。因此，纯化后的蛋白质可用于配体结合分析和其他生化实验。
[] 自2019年底在中国武汉姆被发现以来，SARS-CoV2感染在世界各地肆虐（Wu等人，2020年）。为了跟踪早期感染的进程，在血清学检测中，核衣壳蛋白（N）与棘突蛋白（S）一起用于监测纽约地区早期感染的进程。N是病毒蛋白中最高表达的一种，因此是一个很好的靶点。为了便于这些分析，我们开发了一个纯化方案，并成功地用于这些研究。
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| Targeted Genome Editing of Virulent Phages Using CRISPR-Cas9
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Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] This protocol describes a straightforward method to generate specific mutations in the genome of strictly lytic phages. Briefly, a targeting CRISPR-Cas9 system and a repair template suited for homologous recombination are provided inside a bacterial host, here the Gram-positive model Lactococcus lactis MG1363. The CRISPR-Cas9 system is programmed to cleave a specific region present on the genome of the invading phage, but absent from the recombination template. The system either triggers the recombination event or exerts the selective pressure required to isolate recombinant phages. With this methodology, we generated multiple gene knockouts, a point mutation and an insertion in the genome of the virulent lactococcal phage p2. Considering the broad host range of the plasmids used ...
[摘要] 该协议描述了一个直接的方法来产生严格裂解噬菌体的基因组中的特定突变。 简而言之，在细菌宿主（此处为革兰氏阳性模型乳酸乳球菌MG1363）内提供靶向CRISPR-Cas9系统和适合于同源重组的修复模板。 CRISPR-Cas9系统被编程为切割入侵噬菌体的基因组上存在的特定区域，但是缺少重组模板。 该系统触发重组事件或施加分离重组噬菌体所需的选择性压力。 利用这种方法，我们在毒性乳酸球菌噬菌体p2的基因组中产生了多个基因敲除，点突变和插入。 考虑到本协议中使用的质粒的广泛宿主范围，后者可以外推到其他噬菌体 - 宿主对。
【背景】噬菌体是在每个生态系统中发现丰富的细菌病毒（Suttle，2005; Breitbart and Rohwer，2005），毫不奇怪，它们是牛奶的天然居民。噬菌体p2是乳品工业中发现的强毒乳球菌噬菌体的最普遍组（ Sk1virus ）的模型（Deveau等人，2006; Mahony等人。，2012），它感染革兰氏阳性细菌乳酸乳球菌MG1363，也是基础研究的模式菌株。尽管p2作为参照噬菌体的地位，但几乎一半的基因编码未表征的蛋白质。同样，由宏基因组学确定的绝大多数噬菌体基因在公共数据库中没有功能分配和同系物（Hurwitz等人，2016; Paez-Espino等人， 2016）。
研究基因的方法之一是通过修饰和随后观察所得到的表型。噬菌体基因组只能在宿主内以其生物活性形式进行修饰。强毒噬菌体严格裂解;因此，它们的基因组从未整合到细菌染色体中。这为DNA的体内修饰增加了一个时间限制，只能在短的感染周期内对其进行操作。 ...
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