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Date:
2017-12-20
[Abstract] In this protocol, we describe a method for direct cytosolic protein delivery that avoids endosomal entrapment of the delivered proteins. We achieved this by tagging the desired protein with an oligo glutamic acid tag (E-tag), and subsequently using carrier gold nanoparticles to deliver these E-tagged proteins. When E-tagged proteins and nanoparticles were mixed, they formed nanoassemblies, which got fused to cell membrane upon incubation and directly released the E-tagged protein into cell cytosol. We used this method to deliver a wide variety of proteins with different sizes, charges, and functions in various cell lines (Mout et al., 2017).
To use this protocol, the first step is to generate the required materials (gold nanoparticles, recombinant E-tagged proteins). ...
[摘要] 在这个协议中，我们描述了直接胞质蛋白递送的方法，其避免了递送的蛋白质的内体截留（endosomal embrapment）。我们通过用寡聚谷氨酸标签（E-tag）标记期望的蛋白质，随后使用载体金纳米颗粒来递送这些E标记的蛋白质来实现这一点。当电子标记的蛋白质和纳米粒子混合时，它们形成了纳米组装体，在孵育后融合到细胞膜上，并直接将电子标签蛋白质释放到细胞胞液中。我们使用这种方法在各种细胞系中提供各种不同大小，电荷和功能的蛋白质（Mout et al。，2017）。
要使用此协议，第一步是生成所需的材料（金纳米粒子，重组E标记蛋白质）。先前已经描述了金纳米颗粒的实验室合成（Yang等人，2011）。所需的电子标记的蛋白质可以从相应的基因克隆，并使用标准的实验室程序表达和纯化。我们将在这里使用电子标记的绿色荧光蛋白（GFP）作为参考蛋白。用户可以简单地在任意一端插入一个电子标签到他们感兴趣的蛋白质中。为了达到最大的传送效率，我们建议用户测试不同长度的电子标签。例如，对于我们测试的大多数蛋白质，我们插入了E = 0到20（E0表示没有E标签插入，E20表示20个谷氨酸插入一行），并筛选最佳的E标记长度以获得最高的递送效率。对于大多数蛋白质，E10标记的蛋白质给予我们最高的递送效率（除了Cas9，其中E20标签显示最高的递送效率）。
一旦这些材料准备好了，大约需要10分钟才能制作立即用于递送的E标记蛋白质和纳米颗粒纳米组装体。完成交付（GFP-E10〜100％）在不到3小时内完成。 ...
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