| Mouse Mammary Gland Whole Mount Preparation and Analysis
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Author:
Date:
2018-07-05
[Abstract] The mammary gland undergoes extensive remodeling during pregnancy and is also subject to neoplastic processes both of which result in histological changes of the gland epithelial structure. Since the mammary tree is a complex three-dimensional structure a method is needed that provides an overview of the entire gland. Whole mounts provide this information, are inexpensive and do not require specialized equipment. This protocol describes mammary gland isolation, whole mount preparation and analysis. Mammary gland tissue, which is removed postmortem, is stained with Carmine Alum, a nuclear stain, allowing detection of epithelial structures embedded in the adipose tissue of the mammary fat pad. Stained mammary glands are imaged by light microscopy or embedded and sectioned for histological ...
[摘要] 乳腺在怀孕期间经历广泛的重塑并且还经历肿瘤过程，这两者都导致腺体上皮结构的组织学变化。 由于乳树是复杂的三维结构，因此需要一种提供整个腺体概览的方法。 整个安装提供这些信息，价格低廉，不需要专门的设备。 该协议描述了乳腺分离，整体制备和分析。 在死后取出的乳腺组织用胭脂红明矾（一种核染色剂）染色，允许检测嵌入乳腺脂肪垫的脂肪组织中的上皮结构。 通过光学显微镜对染色的乳腺进行成像或嵌入并切片以进行组织学检查。 诸如Image J的图像分析软件可用于量化分支复杂性，上皮结构重塑或增生变化的扩展。
【背景】尽管乳腺的发育在胚胎发育期间开始并且在出生时存在基本的上皮结构，但是上皮乳树在出生后经历广泛的扩张。响应于激素变化，乳腺上皮细胞增殖并侵入乳腺脂肪垫。在怀孕期间，乳腺上皮经历进一步的分化和重塑以准备产奶。随后，这些上皮结构对断奶作出反应。这些重塑过程由激素，生长因子，细胞因子和细胞外基质驱动。除了响应生理过程的重塑之外，乳腺还经历诸如肿瘤转化的病理过程。这种复杂的生物学以及相对容易的分离使得乳腺成为有用的实验模型。分析乳腺生物学或肿瘤转化的实验研究通常使用小鼠模型来量化基因缺失或过表达对乳腺发育，重塑和肿瘤转化的影响。乳腺整个坐骑允许对乳腺的整个3D上皮结构进行常规和疾病过程的常规检查（Plante et al。，2011; Inman et al。， ...
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| In vitro Osteoclastogenesis Assays Using Primary Mouse Bone Marrow Cells
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Author:
Date:
2018-06-05
[Abstract] Osteoclasts are a group of bone-absorbing cells to degenerate bone matrix and play pivotal roles in bone growth and homeostasis. The unbalanced induction of osteoclast differentiation (osteoclastogenesis) in pathological conditions, such as osteoporosis, arthritis and skeleton metastasis of cancer, causes great pain, bone fracture, hypercalcemia or even death to patients. In vitro osteoclastogenesis analysis is useful to better understand osteoclast formation in physiological and pathological conditions. Here we summarized an easy-to-follow osteoclastogenesis protocol, which is suitable to evaluate the effect of different factors (cytokines, small molecular chemicals and conditioned medium from cell culture) on osteoclast differentiation using primary murine bone marrow cells.
[摘要] 破骨细胞是一组骨吸收细胞，用于退化骨基质并在骨生长和体内平衡中发挥关键作用。 在诸如骨质疏松症，关节炎和癌症骨骼转移等病理状态下破骨细胞分化（破骨细胞生成）的不平衡诱导会导致严重疼痛，骨折，高钙血症或甚至导致患者死亡。 体外破骨细胞生成分析对于更好地理解生理和病理条件下的破骨细胞形成是有用的。 在这里，我们总结了一种易于遵循的破骨细胞生成方案，其适用于评估不同因素（细胞因子，小分子化学物质和来自细胞培养物的条件培养基）对使用原代鼠骨髓细胞的破骨细胞分化的影响。
【背景】骨骼在生命周期内通过连续且良好控制的吸光度和骨量形成来维持。在骨腔中，这两种活性中的每一种都是通过特定的细胞类型进行的：骨形成性成骨细胞和骨降解性破骨细胞。成骨细胞和破骨细胞分别来自骨驻留间充质细胞和造血谱系祖细胞。造血系统骨髓祖细胞分化为成熟破骨细胞主要受核因子-κB配体受体激活因子（RANKL，由TNFSF11编码）和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF，由< ）来自成骨细胞及其祖细胞（suda et al。 ，1999）。与其他细胞不同，破骨细胞通过融合一定数量的祖细胞而分化（boyle等人，2003）。因此，成熟破骨细胞的关键组织学特征是它们的多个核。成熟后，破骨细胞能够通过产生酸化的微环境来溶解主要由磷酸钙组成的骨质以及蛋白酶以降解细胞外基质（boyle等人，2003），从而能够骨吸收。溶解的骨基质释放成骨细胞使用的隔离生长因子以扩大其人群（kassem和bianco，2015）。成骨细胞和破骨细胞之间的这种相互作用确保了协调的骨形成和 - 退化活性，其在包括骨质疏松症，关节炎和癌症骨转移的过多疾病中失调（rodan和martin，2000; raisz，2005; gupta和massague ，2006）。根据之前的文献（lu等人，2009; wang等人，2014; zhuang等人，2017），在此我们描述使用原代鼠骨髓细胞进行体外破骨细胞发生试验的逐步方案，其允许研究广泛范围的因子/条件（例如细胞因子和条件培养基）对破骨细胞的影响分化。 ）来自成骨细胞及其祖细胞（suda="" et="" al。="" ，1999）。与其他细胞不同，破骨细胞通过融合一定数量的祖细胞而分化（boyle等人，2003）。因此，成熟破骨细胞的关键组织学特征是它们的多个核。成熟后，破骨细胞能够通过产生酸化的微环境来溶解主要由磷酸钙组成的骨质以及蛋白酶以降解细胞外基质（boyle等人，2003），从而能够骨吸收。溶解的骨基质释放成骨细胞使用的隔离生长因子以扩大其人群（kassem和bianco，2015）。成骨细胞和破骨细胞之间的这种相互作用确保了协调的骨形成和="" -="" 退化活性，其在包括骨质疏松症，关节炎和癌症骨转移的过多疾病中失调（rodan和martin，2000;="" raisz，2005;="" gupta和massague="" ，2006）。根据之前的文献（lu等人，2009;="" wang等人，2014;=""> ...
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| Biochemical Isolation of Myonuclei from Mouse Skeletal Muscle Tissue
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2017-12-20
[Abstract] Skeletal muscle provides the contractile force necessary for movement, swallowing, and breathing and, consequently, is necessary for survival. Skeletal muscle cells are unique in that they are extremely large cells containing thousands of nuclei. These nuclei must all work in concert to maintain skeletal muscle function and thereby maintain life. The nucleus is a major site of signaling integration and gene expression regulation. However, examining nuclear processes in skeletal muscle can be difficult because myonuclei are challenging to isolate. We optimized a protocol to purify myonuclei from whole muscle tissue using ultracentrifugation over a discontinuous sucrose gradient to separate the nuclear fraction. We used these purified nuclei for downstream applications including flow ...
[摘要] 骨骼肌提供运动，吞咽和呼吸所需的收缩力，因此是生存所必需的。骨骼肌细胞是独特的，因为它们是含有数千个核的极大细胞。这些细胞核必须协调一致才能维持骨骼肌功能，从而维持生命。细胞核是信号整合和基因表达调控的主要部位。然而，检查骨骼肌中的核过程可能是困难的，因为肌核难以分离。我们优化了一个协议，从整个肌肉组织使用超速离心蔗糖梯度来分离核分数的纯化肌细胞。我们将这些纯化的细胞核用于下游应用，包括流式细胞术和质谱。我们使用这种方法来比较年轻和老鼠后肢肌肉的肌细胞蛋白质组（Cutler等人，2017）。这个协议可能适用于分离myonuclei的各种下游分析，如流式细胞仪，显微镜，蛋白质印迹和蛋白质组学。
【背景】为了生存，必须保持适当的骨骼肌功能。这种维持的一个组成部分是根据细胞需要和环境线索调整基因表达。调节基因表达的核过程是调节细胞组成和行为的关键组成部分。然而，由于四个技术限制，涉及这些过程的肌细胞蛋白难以研究。首先，骨骼肌是致密的，紧密地填满了组织中超过60％的蛋白质的收缩性蛋白质（Deshmukh等人，2015; Cutler等人）。 ...
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