| Activation of Fibroblast Contractility via Cell-Cell Interactions and Soluble Signals
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Author:
Date:
2018-09-20
[Abstract] The collagen contraction assay is an in vitro, three-dimensional method to determine the factor(s) affecting the contractile behavior of activated cells such as fibroblasts in either physiological or pathological scenarios. The collagen lattices/hydrogels are seeded with fibroblasts to mimic the interactions between these cells and their surrounding extracellular matrix proteins in the connective tissue. This method is an important platform to assess components as potential therapeutic targets to prevent pathologies such as fibrosis, which are manifestations of hyperactivated fibroblasts. We have described a basic version of this collagen contraction assay, which is amenable to customization using different cell types under diverse experimental conditions.
[摘要] 胶原收缩测定是体外三维方法，用于确定影响生理或病理场景中活化细胞如成纤维细胞的收缩行为的因子。 胶原蛋白晶格/水凝胶用成纤维细胞接种，以模拟这些细胞与其周围细胞外基质蛋白在结缔组织中的相互作用。 该方法是评估组分作为潜在治疗靶标的重要平台，以预防纤维化等病症，这些病症是过度活化的成纤维细胞的表现。 我们已经描述了这种胶原收缩测定的基本版本，其适于在不同实验条件下使用不同细胞类型进行定制。
【背景】细胞外基质的组织收缩和重塑是许多生理条件（例如伤口愈合）中的基本过程。这两种现象的核心是成纤维细胞，它不仅产生和分泌细胞外基质蛋白，而且还可以通过机械相互作用重组它们。有趣的是，这些细胞行为通常在诸如纤维化的病理条件下被夸大（Desmoulière et al。，2005），从而说明需要理解这些过程的分子调节。虽然人们早就知道，胶原蛋白是细胞外基质的主要成分之一，是组织收缩的主要参与者（Bell et al。，1979），对机械细节的透彻理解。这个过程仍然难以捉摸。对体外成纤维细胞胶原基质体外收缩的研究使研究人员能够识别导致组织收缩的新型运动员（Ngo et al。，2006; Su and Chen， 2015年）。基于该测定，可溶性因子如TGFβ（Levi-Schaffer 等，1999）和免疫细胞（Garbuzenko et al。，2002; ...
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| Transmission Electron Microscopy for Analysis of Mitochondria in Mouse Skeletal Muscle
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Author:
Date:
2018-05-20
[Abstract] Skeletal muscle is the most abundant tissue in the human body and regulates a variety of functions including locomotion and whole-body metabolism. Skeletal muscle has a plethora of mitochondria, the organelles that are essential for aerobic generation of ATP which provides the chemical energy to fuel vital functions such as contraction. The number of mitochondria in skeletal muscle and their function decline with normal aging and in various neuromuscular diseases and in catabolic conditions such as cancer, starvation, denervation, and immobilization. Moreover, compromised mitochondrial function is also associated with metabolic disorders including type 2 diabetes mellitus. It is now clear that maintaining mitochondrial content and function in skeletal muscle is vital for sustained health ...
[摘要] 骨骼肌是人体中含量最丰富的组织，可调节各种功能，包括运动和全身代谢。骨骼肌有很多线粒体，这是ATP好氧生成所必需的细胞器，它提供化学能量来促进收缩等重要功能。骨骼肌中线粒体的数量及其功能随着正常衰老和各种神经肌肉疾病以及癌症，饥饿，去神经支配和固定等分解代谢条件而下降。此外，受损的线粒体功能也与包括2型糖尿病在内的代谢紊乱有关。现在清楚的是维持骨骼肌中的线粒体含量和功能对于整个寿命期间的持续健康是至关重要的。虽然有许多染色方法可用于研究线粒体，但透射电子显微镜（TEM）仍然是研究骨骼肌中线粒体结构和健康的最重要方法。它提供关于线粒体含量，嵴密度，组织，自噬体形成以及在各种疾病状况中经常观察到的任何其他异常的关键信息。在本文中，我们描述了一个详细的协议样本制备和透射电镜分析小鼠骨骼肌线粒体。
【背景】骨骼肌是一种高度塑性的组织，经过响应一些细胞外信号的形态和代谢适应性。包括抵抗或耐力运动在内的许多干扰刺激线粒体生物发生，导致增加的代谢能力和抵抗疲劳（Li等人，2008; Sandri，2008）。相反，在衰老期间，不活动，以及在许多分解代谢疾病状态下，骨骼肌线粒体数量和功能下降，导致易疲劳性和胰岛素抵抗增加（Sandri，2008）。功能失调的线粒体的累积也可能导致进行性活性氧物质诱导的损伤，从而进一步损害骨骼肌中的氧化能力（Bonnard等人，2008）。 ...
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| Guanine Nucleotide Exchange Assay Using Fluorescent MANT-GDP
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] GTPases are molecular switches that cycle between the inactive GDP-bound state and the active GTP-bound state. GTPases exchange nucleotides either by its intrinsic nucleotide exchange or by interaction with guanine nucleotide exchange factors (GEFs). Monitoring the nucleotide exchange in vitro, together with reconstitution of direct interactions with regulatory proteins, provides key insights into how a GTPase is activated. In this protocol, we describe core methods to monitor nucleotide exchange using fluorescent N-Methylanthraniloyl (MANT)-guanine nucleotide.
[摘要] GTP酶是分子开关，在无效GDP结合状态和活性GTP结合状态之间循环。 GTP酶通过其内在的核苷酸交换或通过与鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）的相互作用来交换核苷酸。 监测体外核苷酸交换，以及与调节蛋白直接相互作用的重构，为GTP酶如何被激活提供了重要见解。 在该协议中，我们描述了使用荧光N-甲基呋喃酰基（MANT） - 鸟嘌呤核苷酸来监测核苷酸交换的核心方法。
【背景】GTPase是鸟嘌呤核苷酸结合蛋白，调节细胞过程的广度，从蛋白质生物合成到细胞周期进展，从细胞骨架重组到膜运输。 GTPases可以被认为是分子开关，它在GDP结合“关闭”状态和GTP结合“开启”状态之间循环;在通过GTP的GDP核苷酸交换结合GTP时，GTP酶变得活跃并且将结合下游效应蛋白以招募和激活这些效应子的生物学功能。 GTP酶通过与开关I环（G2结构域）的高度保守苏氨酸和开关II环（G3结构域）的DxxG基序内的甘氨酸的相互作用结合GTP的γ-磷酸。 GTP水解后，与γ-磷酸相互作用的丧失导致动态构象变化，从而使GTPase变为关闭状态（Vetter and ...
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